官方微信

仪器百科

您现在的位置:技术字典» 分析测试方法 »正文

血清中尿酸的测定方法及其研究进展

  来源:现代科学仪器|http://www.ms17.cn2008-04-28点击:1558
类型:


 Determination of Uric acid in Serum and Its Developments
Dai Xinhua 1* Xu Ruifeng 1 Zhang Chunmei 2 Quan Can 1 Fang Xiang1 Xu Bei 1
1. Department of Chemical Metrology and Analytical Science, National Institute of Metrology, Beijing, 100013 2. Beijing University of Chemical Technology,Beijing,100013)
Abstract:It is very important to measure of uric acid in the field of clinical diagnosis. There are lots of determination methods for uric acid, such as, enzyme method, capillary electrophoresis, high performance liquid chromatography,and isotope dilution mass spectrometry and so on. This paper systematically summarizes a few familiar determination methods and progress for uric acid.
KeyWords: Uric acid Enzyme method Voltammetry Capillary electrophoresis High performance liquid chromatography Isotope dilution mass spectrometry
1. 前言
尿酸是嘌呤代谢的最终产物,它具有清除氧自由基,抗氧化的作用,但亦有刺激平滑肌增殖的作用1。尿酸是血中主要非蛋白氮(NPN)类代谢产物之一,在正常生理情况下含量相对稳定,但在病理情况下,含量常常发生变动,通过对血液成分的分析,可以了解体内物质代谢状况。痛风、肾病、高尿酸血等都会引起尿酸异常,近年的研究表明血清中尿酸的浓度还与甘油三酯、肌酐的浓度呈正相关性,与心脏损害有关联,因此尿酸的检测和分析对临床诊断,了解病情进展,有重要参考价值2。健康成年人正常尿酸的水平为25-77ug/mL。
尿酸(2,4,6-三羟基嘌呤,简称UA)分子式为C5H4N4O3 ,其分子量MW =168.1116。它是一种白色结晶性物质,较难溶于水、难溶于酸,也难溶于醚和乙

* 戴新华(1973-), 女,博士,从事临床化学和质谱研究。Email: xhdai_75@iccas.ac.cn, 电话:010-64279562。醇。具有弱碱性,可以与强酸成盐。尿酸在生物体内以盐的形式存在,因而溶解度较高。
2. 血清中尿酸的测定方法
目前,测定尿酸的方法主要有酶法、伏安法、磷钨酸还原法、毛细管电泳法、液相色谱法和同位素稀释质谱法等,下面介绍这种常用的检测方法。
2.1 酶法
20世纪30年代酶试剂用于临床生化指标测定,70年代得到了较大发展。目前,临床上常用的检测尿酸的方法为单酶法,其基本原理是通过单一酶促反应后利用各种方法测定底物或者产物的浓度来求待测物含量。反应利用磷酸盐作为缓冲体系,在一定温度下反应一定时间,观察吸光度值,通过计算可以得到尿酸的浓度值。此方法虽然操作简单,但操作过程太复杂。在此基础上人们研究了酶紫外法和重组尿酸氧化酶法。酶紫外法:该法利用尿酸酶对尿酸催化水解作用的特异性及尿酸在293nm处有特定的紫外吸收。随尿酸不断被氧化,吸光度成比例降低,方法回收率101-106%,变异系数CV=1.4%,线性范围172.5-594.8umol/L。此法中酶的用量减少了一半,时间缩短,不需要沉淀蛋白质,但基质中其他组分会产生干扰。目前常规测定法中主要为重组尿酸氧化酶法。本法采用酶试剂盒3分析血清中的尿酸,回收率99%-104%,批内CV=1.8%-5%,批间CV=2.2%-4.6%,线性范围10-250mg/L,此方法虽然操作简单,但其主要缺点是试剂盒价格较贵。此外,还发展了尿酸传感器检测法,目前最常用的是尿酸氧化酶传感器检测法4。尿酸传感器采用流动注射分析系统,当一定的试液注入样品混合器后,与流速为1.5ml/min的磷酸缓冲液(PH=8.5,浓度0.02mol/L) 混合,经热交换器恒温(32 ±0.1)℃,进入反应室在固定化酶催化下进行氧化反应,使反应液中溶解氧浓度下降,这样,氧电极就产生差异电流响应峰,由积分仪记录下来。当溶液中的尿酸经载流液洗脱离开酶反应后,电极很快回到起始状态,信号随即回到基线,就可以进行第二次注射分析。
但是,以上的各种酶法受不同试剂、仪器等的干扰,各个方法之间的检测结果偏差很大,检测结果没有可比性。
2.2 伏安法
Kolthoff和Laitinen等人把基于研究电流-电压曲线特性进行分析的方法统称为“伏安法”。伏安法是目前较常用的检测尿酸的方法,近年来,伏安法检测尿酸在理论研究和实际运用于临床诊断上都取得了很大的发展。伏安法检测尿酸常用的方法有以下2种:
2.2.1 微电极差示脉冲伏安法
在电极表面修饰一层化学物质分子, 赋予电极以特定的性质, 能有效地降低某些氧化还原物质的过电位, 从而达到分离或同时测定的目的。目前,微电极差示脉冲伏安法常用的是聚甘氨酸修饰碳纤维微电极差示脉冲伏安法,利用碳纤维微电极(CFME)经过特定的电化学方法活化,活化后的CFME表面修饰一层聚甘氨酸膜,该膜电极对尿酸有近可逆的响应,借助于差示脉冲伏安法(DPV)技术,它检测尿酸的灵敏度达2×10-8mol/L,检测线性范围为3.3×10-7-8.0×10-6mol/L(t=70s)。该方法测定结果较为准确,可望用于在线检测,但目前应用不是十分广泛。
2.2.2 吸附溶出伏安法
此法灵敏度高,有一定选择性,是测定尿酸的新方法。具体实验方法是在电解池中加入Britton-Robinson缓冲液(PH=7.50)和适量的尿酸溶液,除去体系中的氧气,插入三电极系统,选择合适的富集时间,在+0.10-0.80V范围内用溶出伏安仪记录其伏安曲线,可用于血浆中尿酸的分析。此方法的线性范围为2.0×10-8-1.0×10-5mol/L,检出限量为1.0×10-8mol/L。该法抗干扰能力较强,操作简便,样品处理简单,易于推广。上述系列方法中,很多内源物质、外源物质或者仪器本身对测量产生干扰。后来人们研究发展利用高效液相色谱测定血清中的尿酸。
2.3 高效液相色谱法
高效液相色谱法的一般操作为:1)制备标准溶液,2) 建立标准曲线,3)对血清样品进行前处理,4)应用事先确定的色谱条件对标准溶液和样品溶液分别进行测定。周永国5研究利用HPLC方法同时测定血清中的肌酸、尿酸和肌酐。其色谱条件:NovaPak C18色谱柱(3.9X150mm,Waters),以0.02mol/L KH2PO4为流动相,PH=6.5,流速1.6ml/L,检测波长为220nm,柱温为室温。其前处理方法:取0.5ml血清,加蒸馏水3.5ml,加入0.5ml浓度为0.33mol/L的硫酸溶液,沉淀血清中尿酸,同时加入浓度为10%的钨酸钠溶液0.5ml,离心沉淀蛋白质等大分子。此方法的检测限为0.21ug/ml,回收率95.5%。Zhirl等人6采用反相液相色谱测定血清中的尿酸。色谱条件:ODS-C18反相柱(150X4.6mm,5um粒径),流动相为30mmol/L的乙酸铵与156mmol/L的甲醇混合溶液,PH=7.0,方法的回收率94.4%,检测限9.5umol/L,线性范围高达1.5X103umol/L, 批内CV=4.25%,批间CV=2.78%。彭长华等人7同样利用反相高效液相色谱法检测血清中的尿酸。本法用甲醇沉淀蛋白,取上层清液用氮气吹干,再用流动相重新溶解后进样,避免了上清液溶剂强度远大于流动相本身引起的色谱峰分离不良。色谱条件:Shim-pack CLC-ODS(150X6.0mm)色谱柱,同时采用了预柱,流动相为0.02mol/L KH2PO4,PH=3.2,流速1ml/min,柱温35oC,检测波长为263nm。Sakuma等人8讨论了不同的样品前处理方法对测定血清中尿酸含量的影响。色谱条件:ODS-120A柱(250X4.6mm,5um粒径),流动相为2%甲醇,PH=2.2,浓度40mmol/L的磷酸钠缓冲液,流速1.0ml/min,检测波长=284nm,实验证明采用高氯酸沉淀血清中的蛋白质,尿酸的回收率最高,同时方法的精密度最好。1988年Tanaka等人9利用一种亲水性的多孔高分子凝胶作为色谱柱的填充材料,样品不用进行前处理就可以进行直接进样分析。具体方法:色谱柱 GS-320,100X76mm,粒径9um,检测波长290nm,流速0.8ml/min,流动相PH=7.0,50mmol/L的磷酸盐缓冲液。方法的检测限2.5mg/L,回收率99-100.3%。此方法相对较简单,快速,但一根色谱柱只能检测有限样品,成本相对较高。已报道的这些HPLC方法常常需要麻烦费时的样品前处理技术。Seki等人10采用柱切换技术检测血清中的尿酸。他们运用了6种不同的柱子连接后对样品进行分离和定值。此方法的样品前处理很简单,只需将血清稀释和过滤,但是需要使用复杂的柱切换设备。
2.4毛细管电泳法
Grune 等人11用高效毛细管电泳法同时检测了系列嘌呤碱和核酸。方法采用高氯酸(浓度为7%,V/V)沉淀蛋白质,高氯酸用量与加入血清量相同,硼酸(浓度为20mM)作为缓冲体系,PH=9.4。用紫外检测器检测波长为260nm,电压20kV,方法线性范围1-125uM,检测限0..5uM。Xu等人12采用毛细管区带电泳对血清中的尿酸进行定性和定量。他们用30cmX25uM(I.D.)熔融二氧化硅毛细管柱,采用两性离子缓冲液,用碳纤维作为工作电极,方法的检测限为0.48 fmol。与液相色谱法相比,此方法前处理相对较简单,线性范围宽,进样量少,较为适合于日常分析用。
上述四种方法一般用于血清中尿酸的常规检测,这些方法需要用标准物质来校准,从而保证检测结果的准确性和可比性,因此人们研究了血清尿酸检测用的基准方法,即同位素稀释质谱法。
2.5 同位素稀释质谱法
1995年国际物质量咨询委员会(CCQM)在巴黎召开的第六次会议,将同位素稀释质谱法(Isotope dilution mass spectrometry, ID/MS)、精密库仑、电位滴定、凝固点下降和重量法定位于具有绝对测量性质的方法。其中,ID/MS是唯一一种微量、痕量和超痕量物质含量的权威测量方法。近年来,ID/MS是最常用的临床检验量值的基准方法。通过向样品溶液中加入一种同位素标记物作为内标物,在溶质与标记物溶液充分平衡以后,对样品进行预处理,利用GC或LC-MS测定标记物与溶质的峰强度比来测定溶质的浓度。该法具有特异性高、准确度高等特点。目前国际上正利用ID/MS作为基准方法为人体血清中的胆固醇、葡萄糖、尿酸、尿素、肌酐以及甘油三酯等定值。
2.5.1 气相色谱/同位素稀释质谱法
Siekmann等13将[1,3-15N2]尿酸标记物加入血清样品中,室温下充分混合30min,离子交换色谱进行净化,用乙酸将尿酸洗提出来,80℃氮气吹干,将残留物用甲基氨溶解,再次吹干。用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺进行三甲基硅烷化衍生,最后用气相色谱/质谱联用技术进行检测。并根据同位素稀释法的原理计算血清中尿酸的含量。
Ellerbe等14也研究采用 [1,3-15N2]尿酸同位素标记物作为内标,利用GC-ID/MS方法测定血清中的尿酸。在血清中加入[1,3-15N2]尿酸同位素标记物,轻轻搅拌均匀,室温下静置一个晚上,充分平衡。平衡后的混合物经阴离子交换色谱柱净化,然后用乙酸洗提,所得尿酸溶液在60oC下用N-甲基-N-三甲硅烷基三氟乙酰胺进行衍生化反应。然后用GC-MS分析。采用EI电离源,电子能为72eV,灯丝发射电流0.5mA,离子源温度200oC,分流比40/1,柱温255oC,载气为氦气,流速3ml/min,进样口和转换线均为250-270oC,采用选择离子检测监控m/z=567和569。采用括号法定量,方法的精确度很高,对于高浓度样品其RSD=0.37%,对于低浓度样品RSD=0.34%。
2.5.2 液相色谱/同位素稀释质谱
在GC-ID/MS分析中,需要采用样品预处理手段,包括净化、离子交换、衍生化等等。因此样品的前处理过程比较复杂、费时、且成本较高。因此人们正在研究开发LC-ID/MS方法,此方法样品的前处理比较简单,一般只需沉淀蛋白质或者过滤,然后直接利用液相色谱柱即可将尿酸进行分离和定量。但是,目前国内外还未报道采用液相色谱-同位素稀释质谱法准确测定人血清中的尿酸。
3. 国内外血清中尿酸临床参考系统研究现状
从上述尿酸检测方法的发展可以看到,国际上针对血清中尿酸的常规方法、基准方法及参考方法已经开展了广泛深入的研究,并取得不少进展。其中尿酸的定值方法已经采用气相色谱同位素稀释质谱法。我国临床检验量值溯源性基础研究目前处于初始阶段,与国外的研究水平差距很大。目前只有血清中胆固醇的研究具有比较完整的参考系统,该参考系统由国家标准物质研究中心制备的纯度标准物质(GBW 09203a和GBW 09203b,一级参考物质)、卫生部北京老年医学研究所建立的参考方法及该所制备的血清标准物质(GBW 09138,二级参考物质)组成。国内相关单位正在开展甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白等指标的标准化问题的研究。然而国内尚未建立血清中尿酸的基准方法和参考系统。在目前全球改进医学测量准确度,建立全球认可的体外诊断参考系统的形势下,建立我国的参考系统非常迫切。中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所(原国家标准物质研究中心)应国家科技部的要求,正在研究利用液相色谱-同位素稀释质谱(LC-ID/MS)法对血清样品中的尿酸进行高准确度测量方法的研究。
4. 临床意义
尿酸是一种内源性抗氧化剂,主要由细胞代谢分解的核酸和其它嘌呤类化合物以及食物中的嘌呤经酶的作用分解而来。尿酸的含量是临床中最常测量的量。近年来,随着人们生活水平的提高,饮食结构的变化,嘌呤的摄入量也明显增加,高尿酸血症患者明显增多,引发了一系列疾病15。1)体内尿酸过量,可导致痛风,测定血清尿酸含量对痛风的诊断和观察是一项灵敏的指标16; 2)尿酸水平可反映体内超氧阴离子自由基水平,在急性脑血管病发作时,产生大量超氧阴离子自由基,所以脑出血、脑梗塞患者血清尿酸较正常人有明显升高;3)血清尿酸含量测定可为心力衰竭疾病的诊断提供重要的依据17,血清尿酸水平升高是心血管疾病恶化及其死亡率增加的一个危险因素,检测尿酸水平是评估其预后的一个有意义的生化指标;4)血清尿酸增多还见于各种类型的肾脏疾病18:肾功能衰竭早期, 即可出现血清尿酸含量明显升高,因此血清尿酸含量是预防肾脏疾病的一个早期灵敏可靠的指标之一;5)血清尿酸含量测定在糖尿病诊断方面具有重要意义19:糖尿病患者血清尿酸水平显著高于正常人,尿酸的增加是糖尿病的主要特点之一20,尿酸定量测定可作为其检测的一个重要指标;此外,血尿酸测定对白血病21、冠心病、肺心病和肝硬化的诊断和观察均具有一定的意义。可见,血清尿酸含量测定是临床检测的极为重要的生化指标之一,为临床诊断和观察疾病提供了可靠的依据22。

致谢:本课题得到科技部国家科技基础条件平台2004DEA10160-3-5和2005DKA10804的支持,谨致谢意。
参考文献
1 邹小秋. 尿酸对培养人脐静脉内皮细胞NO-NOS 通路及 ADMA-DDAH 系统的影响(D),.江西:江西医学院,2004
2 王吉寿,张振华. 非胰岛素依赖型糖尿病患者血尿酸水平检测的临床意义,职业与健康,2003,19(5):37-38
3 林海谅. 多发性硬化的临床分析及血清尿酸与多发性硬化关系的探讨(D),福建,福建医科大学第一临床医学院,2004
4 彭翠华,彭建宏. 快速消除溶血干扰检测血尿酸的方法,湖南医学高等专科学校学报,1999,1(3):28-29
5 周永国. 高效液相色谱法同时测定血清中肌酸,尿酸和肌酐,分析科学学报, 1998,14(1),52-54
6 Azzedine Zhirl,Odile Houot,Maria Wellman-Bednawska,et al. Simultaneous determination of uric acid and creatinine in plasma by reversed-phase liquid chromatography,Clin. Chem.,1985,31(1),109-112
7 彭长华,王昌富,李承彬,等. 色谱,1998,16(.2),146-148
8 Ryozo Sakuma,Toshihiro Nishina,Motoshi Kltamura. Deproteinizing methods evaluated for determination of uric acid in serum by reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detection,Clin. Chem.,1987,33(8),1427-1430.
9 Mitsunso Tanaka,Michlo Hama. Improved rapid assay of uric acid in serum by liquid chromatography,Clin. Chem.,1988,34(12),2567-2568
10 T.Seki,Y.Orita, K.Yamaji. et al. J. Pharm.Biomed.Anal.,1997,15,1621-1626.
11. T. Grune,G. Ross,H. Schmidt, et al. Optimized Separation of purine bases and nucleosides in human cord plasma by capillary zone electrophoresis,1993,636(1), 105-111.
12 . K. Xu,L. Hua,Z. M. Li,et al. Identification and quantitative determination of uric acid in human urine and plasma by capillary electrophoresis with amperometric detection, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl.,1997,694(2),461-466.
13 L. Siekmann. Determination of Uric Acid in Human Serum by Isotope Dilution-Mass Spectrometry,J. Clin .Chem. Clin .Bliochem, 1985,23,129-135.
14 Polly Ellerbe,Alex Cohen. Determination of Serum Uric Acid by Isotope Dilution Mass Spectrometry as a New Candidate Definitive Method,Anal.Chem.,1990,62, 2173-2177
15 殷丽. 血清尿酸含量在临床上的应用,中国误诊学杂志,2004,4(5),33-35
16 尹莹. 电针加药物治疗急性痛风性关节炎的临床研究(D),武汉,湖北中医学院,2004
17 费劲松,季鸿,陈范元. 老年高血压病患者颈动脉粥样硬化程度与血清尿酸和胆红素水平的关系,现代医学卫生,2004,20(14),1322-1323
18 崔全永. 急性心肌梗死、脑梗死与血尿酸关系分析,检验医学,2004,29(2),178
19 陈劲松,胡利东. Ⅱ型糖尿病并发冠心病患者血清尿酸水平测定,中国现代医学杂志,1997,7(11),27
20 朱敏,俞茂华. 2型糖尿病合并高尿酸血症的相关因素分析,复旦学报(医学版),2004,31(1),71-73
21 蔡莉莉. 对白血病患者血清尿酸的检测探讨,实用临床医学,2002,3(4),11-12
22 Christopher J,Kochansky,Timothy G. Strein, Determination of uremic toxins in biofluids: creatinine, creatine, uric acid and xanthines, Journal of Chromatography B, 2000,747,217–227.
  (来源:现代科学仪器|http://www.ms17.cn

关注本网官方微信 随时阅权威资讯