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贴壁细胞消化传代中常见问题的解答

  来源:丁香网论坛2009-03-19点击:3177
类型:


 

        贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法:一、加入胰酶等细胞脱落后,再加培养基中止胰酶作用,离心传代;二、加入胰酶后,镜下观察待细胞始脱落时,弃胰酶,加培养液分瓶。但前者太麻烦,而后者有可能对细胞施加胰酶选择,因为总是贴壁不牢的细胞先脱落,对肿瘤细胞来说,这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。
       介绍一种简单的消化传代方法和各位共享。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用(30s),弃之,再加入适量胰酶作用10s-40s(根据细胞消化的难易程度),弃之,这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。
1、洗去血清
2、加1/5V PBS/D-Hank‘s,2到3次
3、1/10V 胰酶
4、镜下观察,见突起缩回(细胞间隙增大)即加含血清培液
5、吹打后(加培液)
6、分种

       对于较难消化的细胞,可以用2%利多卡因消化5-8分钟,然后再弃去,加培养基吹打也可以,对细胞的影响不大。
1、弃去旧培养液,PBS或D液清洗2-3遍(除去旧培养液中血清的影响);
2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴(25cm2的培养瓶),使胰酶刚刚可以布满整个底;
3、作用1min左右,用含10%血清的培养液3-5ml中和;
4、轻柔吹打细胞脱壁, 离心。
        赞同不用PBS也不用Hanks洗,只要把旧培养液吸的干净一点,直接加酶消化应该不会有什么问题。
对付难消化细胞的做法是弃取培养液后,用0.04%的EDTA冲洗一次,再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min,弃取大部分EDTA,加入与剩余EDTA等量的胰酶(预热)总体积1/10v。消化到有细胞脱落。不过有人说EDTA对细胞不好。 
         EDTA对细胞有损伤作用,一般在难消化的细胞才和胰酶合用,用了EDTA后把细胞离心后洗几遍洗去EDTA。
首先,EDTA对细胞肯定有伤害,EDTA可以与细胞膜上很多大分子蛋白上的中金属成分发生螯合,致使蛋白变性影响蛋白质的生物活性而发生损伤。 
        但是,这种损伤是可逆的。就细胞传代所用的浓度和时间条件下,还不致对细胞产生过大影响。其实Hyclone的胰酶中就有EDTA。
        因此在一般细胞操作中不能用TE代替PBS洗细胞。
        如果EDTA对细胞的伤害不是可逆的,想象一下,过去重金属中毒时用EDTA解毒岂不是又喝了一种毒药!
       

        培养的BASMC:倒掉旧培养液,加入少量胰酶冲一下,倒掉,再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml(25ml bottle)消化,再加入适量新培养基中和,并分瓶 这种方法简单、省事;效果很好并且不损失细胞!

问题1:
        我的细胞消化要用EDTA加胰酶消化20分钟,有什么好办法?
解答1:
        先用PBS把细胞洗两遍,使瓶内没有血清了,减少对胰酶的中和,然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右,放在37度,然后可以在细胞有些消化下来时,拿着瓶口,运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体,这样细胞很快就下来了,还不需要吹打,分散也均匀

问题2:
        消化细胞后都用什么洗涤呀?带血清的PBS,还是直接用PBS,或者是用培养液呀?我原代培养的细胞二次接种后总是有些细胞铺不开,有些又铺很好,不知是什么问题,求教一下
解答2:
        不管是进口血清或是国产血清,都用PBS直接冲洗三次即可,没有必要用DMEM或加血清的培养液。见意你查查胰酶消化的原理,本论坛中就有,加了血清胰酶怎么消化呀。
       

        细胞铺不开,原因有二:一是消化时离心管中的细胞没有吹打开,解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基,用吸管轻轻吹打,吹打开后,再加培养基,这样细胞不会成团,培养基太多,细胞不容易吹打开。二是接种时,培养瓶中先加培养基,再接种细胞,接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀,其结果就是细胞铺不开。 
        养MSCs,传代时候胰酶消化过后,用加血清的培养液终止消化,再离心。弃上清夜,再加入含血清培养液,重悬浮细胞,吹打均匀,计数,安所需密度接种。先用少量培养液,比如1到2ml,润湿培养瓶,然后再接种细胞原因是如果直接接种细胞的话,肯定有的地方接触了较多培养液,而有的地方几乎就没有培养液,细胞当然不会在没有营养的地方待着了。 
        总之,先用少量培养液润湿应该是一个解决办法。
我们的观点为:
1、不洗的细胞传代后,次日一般要换液一次,除去没有贴壁的死细胞.如果是悬浮生长的细胞则不用处理。
2、用离心洗涤来出去残留胰酶是不必要的,增加污染机会,也造成细胞丢失,还会使些一些细胞死亡。

问题3:
        以前一直养悬浮细胞,现在养贴壁细胞,总感觉消化时间老是把握不好,有时候消化过头了,损失很多细胞;有时又消化不充分,导致吹打时候困难,恳请各位给予指点!
解答3:
        消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间,掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强,配好后可分装成小管,一次用完,其余冻在-20℃,以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可,可放入培养箱中,因外在37℃时酶的活力高于常温,有利于缩短消化时间。还有一种方法,就是将胰酶铺满瓶底后,轻摇培养瓶,使胰酶与细胞充分解除,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70~80%瓶底时消化较好,若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
        消化时间不应超过5分钟,否则对细胞损害很大。消化液覆盖细胞,成一薄膜,然后反复倾斜,使消化液冲刷细胞,当细胞收缩,部分细胞脱落时,可用完全培养基马上中和,同时吹打壁上细胞。应该没问题。
        消化的时间不能一概而伦,要看你的细胞的种类,即使同一种细胞,在不同的细胞株也回出现消化的时间不同的现象,象我们实验室以前的VERO细胞就很好消化,一般就是2-3分钟左右,现在重新拿了一株新的VERO细胞平均每次消化在5分钟以上;其次要看你配的胰酶的质量,如果配的比较好,消化的时候就要好消化一点,反之就久一点。还要在你看到消化过头的情况下,如果细胞下来的比较多了,这时你把CMF或PBS连同细胞弃去是很浪费的,你还不如就连同CMF或PBS加上营养液一起传,因为营养液中有血清,胰酶一遇到血清就会自动终止消化,当然这样对你的细胞是有一定的影响的,但是这也是补救的唯一方法,我消化过头的时候都是这样处理的,只要你的血清质量够好,细胞一般都会张的较好。

问题4:
        本人用胰酶冷消化细胞后,终止消化后,发现絮状的组织细胞怎么也吹不散,都不容易移入培养瓶。是为什么呢?
解答4:
        我们实验室使用胰酶消化细胞时胰酶并不预热,而是直接从4摄氏度冰箱中取出在室温中直接使用,对消化效果影响不大。不过我想可能有几个原因:
        其一:细胞生长过度,也就是在有限的空间里面细胞数量太多,相同时间内消化进行不彻底,导致大量细胞间连接没有破坏掉。
        其二:消化时间不够。
        其三:楼上所说的情况我还没有经历过,可能也存在吧。不过我想应该取决于楼主用胰酶消化的细胞的性质。
        在培养人前列腺癌细胞PC-3M时也遇到过类似问题。当时是准备做流式,看药物对细胞周期和调亡的影响。首先排除了药物对细胞的影响,后来发现可能是由于细胞属高度转移的细胞系,贴壁不牢,常规消化会破坏细胞膜,出现非常难吹散的白色絮状物。于是尝试了以下两种方法:1、加入消化液使其扑满瓶底后迅速将其倒出,缩短消化时间。2、不使用消化液,用培养液直接将贴壁细胞吹打下来。此法会造成细胞丢失,但完全避免了消化液消化过度的影响,在细胞量较大时可尝试。此外,还在文献上看到常规消化后,加入含血清的PBS洗细胞,终止残存消化液的作用,我没有亲自尝试过。
        其实冷消化和热消化都无所谓,当然一般热消化会比冷消化要好一点,因为胰酶在加热时活性高一些,这取决于你的细胞.出现絮状物可能是你的细胞破碎后DNA释放造成,你可以试用DNase把它裂解掉.我也曾遇见过类似情况,加DNase就没有了.当然也可能是其它原因,你可以摸索一下.DNase使用浓度一般20-30u/ml,你可以在配胰酶时直接加到胰酶中.

问题5:
        我培养的是卵巢癌患者腹水中提取的原代肿瘤细胞,现在已经铺满瓶底。今晚消化传代时,发现用胰酶后消化15分钟,也只有少部分细胞变圆飘起,大部分细胞稍有皱缩,但是贴壁还是很劳。吹打也掉不下来。
我的胰酶是3-28配的,配好后一直放在4度冰箱。是不是胰酶失效了?还是原代细胞就是难消化?

回答5:
        胰酶配好分装后,置-20度备用,使用之前37水浴溶解,25cm2的培养瓶用2ml的胰酶,所以分装时,尽量考虑到每次的用量,一次拿出来就用完。避免胰酶反复冻融超,易失效。
       胰酶消化时,要在37度培养箱内,一般0.25%胰酶2~3分钟,0.05%胰酶-EDTA 3~5分钟,贴壁细胞即可完全飘起。
       象你这种情况,估计是胰酶失效,3月28到今天4月17日,你只是把胰酶放在4度保存,时间和温度都不合适。
也有一种可能性:生长状态不好的细胞,消化时间也会延长。但我们还没有消化超过5分钟还不能work的情况。

  (来源:丁香网论坛

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