Waters高效液相色谱仪标准操作规程

1.目的

描述Waters高效液相色谱仪标准操作规程。

2.适用范围

化验室

3.责任者

化验员应严格遵照该操作规程,QC主管负责监督本规程的实施。

4.定义

HPLCHighPerformanceLiquidChromatography,高效液相色谱仪。

5.安全注意事项

5.1有机溶媒有害健康，各溶剂瓶口应封严。
5.2注意检查废液桶中废液应避光，防止废液桶满外溢。

6.规程

6.1.WatersHPLC的组成：贮液器®输液泵®自动进样器®分离柱(柱温箱)®紫外检测器®控制及数据处理系统(Millennium32化学工作站)。

6.2.HPLC系统的打开及关闭顺序

6.2.1打开顺序

·对于分体式：请按泵、进样器、柱温箱、检测器的顺序打开开关，待各部分分别显示初始化完毕后，最后打开Millennium32化学工作站。

泵与色谱工作站的连接：对于510泵，因为此泵与色谱工作站是单向联系，如要使泵在Remote状态下由工作站控制，首先要在泵的键盘上按Menu键，待显示屏切换至Mode状态下，其状态是Loca，按Edit/Enter键，在Local的L前有闪动的光标显示，按Ù键，Local转换成Rem，再按Edit/Enter键，此命令已输入进去,最后按Stop/Run键，使泵处于Run状态这时泵和工作站的连接即告成功。泵的任何动作都可由工作站来控制。还应注意这一步工作在每次开机时都要进行。

对于Alliance2690系统：先打开Alliance2690主机、检测器电源开关，待初始化完毕后，再进入Millennium32化学工作站。

对于流动相的要求：对于液体试剂应尽量采用色谱纯试剂；对于所用到的固体试剂应采用分析纯试剂；对于水，应采用经纯水机处理过的超纯水；流动相在使用前一定要经0.45mm的滤膜（滤膜分为水相膜与有机相膜，确保使用正确的滤膜，参见附表)过滤、超声真空脱气方可使用，严禁含盐的流动相未经过滤直接使用。

应养成良好操作习惯：

规范操作，树立保护HPLC整套系统的概念，尤其对于输液泵、色谱柱、检测器，在使用后应及时冲洗，以免污染而使其寿命缩短或损坏，尤其如操作者使用了含盐的流动相，更应注意清洗的步骤：首先用脱过气的纯水在流速为1ml/min左右冲洗30～60分钟，再用含50％以上甲醇或乙腈的水溶液以相同的流速冲洗20～30分钟左右。

如要卸下柱子，在经过上述冲洗过程之后，再经纯甲醇或乙腈以1ml/min的流速冲洗20~30分钟，柱子卸下后应马上拧紧柱堵。

流速的变化应采用阶梯式递增或递减的方式，启动泵时，应在2分钟之内由小流速慢慢增大到所需的流速，泵关闭时亦然(流速递减)。切忌流速的骤变。

6.2.2关闭顺序

首先退出Millennium32化学工作站，再关闭系统的其他部分。 6.3.Millennium32化学工作站

Millennium32色谱管理系统是集数据采集、处理、HPLC系统的控制、结果的管理、报告的打印为一体的综合系统。下面就着重介绍该系统的基本操作知识。

6.3.1Millennium32化学工作站的进入

打开化学工作站，系统自动进入ProgramManager界面，双击Millennium肖像，这时进入Millennium界面，双击SessionManager图标，系统将自动初始化，以使工作站和HPLC整套系统进行联接。初始化后，按系统要求键入你的UserName和Password，这时你已进入该系统。

6.3.2Project的进入和建立

·Project的进入：在SessionManager窗口下，击Project肖像(或从View中选择Projects),在其中有已建好的Project，双击你所需的Project肖像，再进行你想做的工作。

·Project的建立

从File中选择New，即显示NewProject的画面。

在ProjectName中输入你的Project名称。

在InitiallzeProject项目中选择Copy中的filterandfields或Methods。

在FromProject中选择要拷贝的现存Project。

选择Tablespacesize。

选OK，存贮并退出。
当Millennium软件在建立一个新的Project时，在屏幕上及时显示出完成建立新Project的百分比。当达到100%时，在SessionManager画面即出现一个新的Project肖像。

6.3.3收集数据的一般过程

使用Millennuium32收集数据的一般过程如下：在Project窗口内建立收集数据所需仪器的仪器方法；建立包括此仪器方法的方法组；使用此方法组收集数据。

本部分包括：建立仪器方法，建立方法组，收集样品。

·建立/修改仪器方法

从SessoinManager窗口，打开所需的Project。

选择Method按钮，现存的方法的肖像即出现在屏幕上。

从命令菜单中选择File，然后选择其中的NewInstrumentMethod，即出现SystemOpen对话框。

在目录中选择收集数据需要使用的色谱硬件系统的名称，如：System_1。按OK，这时InstrumentMethod窗口即显示出来。

窗口的上部分是该系统的所有仪器的肖像。用鼠标器将需要设定仪器参数的仪器部件激活，然后在仪器肖像上双击两下，即出现InstrumentDialogBox画面。

对各个部件设置操作条件，或通过输入新的参数来更改以前的参数。例如：定义泵参数，先双击SIM/PCM的肖像。填写泵参数，按OK。

当所有参数设置完成后，按OK。即回到InstrumentMethod窗口。选File中的SaveAs存贮仪器方法文件，如有需要，起一文件名，按OK。

选择File中的Exit，即回到Project窗口。新的仪器方法肖像即出现在此窗口下。

·建立方法组(MethodSet)
仪器方法编好后，必须存于一方法组中，才能在QuickSetControl中调用。 在Project窗口下选方法肖像。

选File中的NewMethodSet，即显示出MethodSet对话框。

在此画面的InstrumentMethod一栏，选择已确定的仪器方法。其他项目可空着不填。然后选File，SaveAs。输入方法组名后，按OK。

选File，Exit。即退回到Project窗口。新设置的方法组肖像即出现在此窗口下。

·收集样品：完成以上各步骤后，即可收集样品。

在Project窗口下选择QuickSetControl肖像。出现SystemOpen对话框。

选择建立仪器方法时确定的色谱硬件系统，按OK。即出现QuickSetControl窗口。

在此窗口下的SampleLoadingTable中用鼠标器按第一行，这时Millennium软件会自动填充各项初始参数。通过输入新值可更改表中的各项参数，表中的瓶号(对于高效液相色谱仪的进样表，除另有规定外，按括号法安排进样顺序。即第一针为标准品1作为系统适用性共进6针，要求RSD不大于2%，随后为标准品2，进样次数为2针，然后为样品1到样品3，各进2针。样品3后为标准品1，依次类推，直到将所有样品都安排在进样表中)进样次数，进样体积，运行时间等项目对自动进样器有控制作用。

在MethodSetReport一列中选择在前面刚刚建立的方法组。

在运行方式(mode)中选RunOnly。

选择进样方式：菜单mode下选单个样品或样品组进样。

将SampleLoadingTable中第一行点黑。击SetupInstrument按钮，启动系统。

系统启动后可击baselinemonitor图标，即可观察基线。

待基线平稳后，击绿灯或样品盘肖像准备进样。出现Injectorwait提示信息，随即进样。

在样品测试过程中，系统会在QuickSet窗口下显示瓶号和进样次数及运行时间。并可在此窗口下观察检测器的输出情况。屏幕上显示的检测器输出是自动满量程方式(即自动按最大信号满格输出)。

当收集完色谱数据后，选择File，Exit。退出QuickSet窗口。样品收集完成后，Millennuium32会自动存贮收集的数据。

6.3.4建立数据处理的方法

在Millennuium32中，完成不同的任务需编辑不同的方法，如仪器方法(收集数据)，处理方法(定性定量分析)，报告方法(打印实验报告)等。

本部分包括：

*重新调出色谱峰进行观察。

*谱图积分及确定积分表中的参数。

*输入组分表资料。

*存贮数据处理方法。

·调阅色谱图

进入在其中收集样品的Project，在此窗口下选Channel肖像。

在ChannelViewTable中选择欲进行色谱分析的文件行并使其变黑。

在Tools下选择Review肖像，这时在ReviewData窗口下即显示出你调入的色谱图。

选File，NewMethod。在NewMethod对话框中指定数据处理的类型，如LC，选OK。·色谱图的积分

选View，IntegrationTable。在屏幕下部即出现IntegrationEventTable。

在PeakWidth，MinimumArea，MinimumHeight方框中输入适宜的数值。

按Integration按钮，观察积分情况，并适当进行积分参数的调整。

·输入组分资料

选View，ComponentTable。即可见到空的组分表。

选Options，FillTableFromResult，即可自动填充积分完毕的色谱图的组分表。也可用手动方式修改表中的参数。

按Calibration/Quantitate后，选View，ResultTable。即可看到积分的结果。
·存贮数据处理方法

在ReviewData窗口下，选File，SaveMethod。在ProcessingMethodSaveAs对话框的窗口下输入数据处理方法名称。

按OK，贮存ProcessingMethod。在组分表的上方可看到新的ProcessingMethod的名称。

选File，Exit。即可退出ReviewData窗口，回到Project窗口。

6.3.5重新观察色谱结果

·进入你所需的Project窗口。击ResultView肖像。

·在ResultViewTable中选择你想观察的色谱数据。

·击Review肖像，你所选择的第一个色谱数据的谱图将在ReviewData窗口下，其结果将显示在ResultTable中的第一行。

·按NextCh/Inj的方框即可看到下一针进样的有关资料。

·选File，Exit。即可回到Project窗口。

6.3.6报告方法的编辑及试验报告的打印

·启动报告出版系统

进入“PROJECT”窗口。

在Views下按一下方法肖像。

选择File，NewReportMethod。这时即可编辑新的报告方法。

在报告排版窗口中，右边为一张模拟的白纸，左上方的列表为排版时可放置在右边纸上的项目。如图谱，积分表，样品信息，仪器方法等，左下方为报告头标和脚标（如土〕。选择Individual为每个结果有一个报告，选SummaryofResultSetsAll方式为打一个集中的报告。按OK。

·设计报告格式
按一下ChromatogramGroups肖像。在ChromatogramGroups列表中选择Auto-scaledChromatogram。并在报告页面上按一下，用鼠标器将此图形放在画面合适的位置上。

用鼠标器将箭头放在画面的边缘，当箭头变成双箭头时将图形放大或缩小。

选择Format，Landscape。可将图谱垂直放置。

按一下MethodGroup肖像，从MethodGroup的列表中选择InstrumentMethod，并在报告页面上的合适处按一下。这时InstrumentMethod方框将出现在报告页面上。

按一下TableGroups肖像，在TableGroups，并在报告格式上的合适位置上按一下。

选择Format，PageSize。可改变报告尺寸的大小。 选择Customize，Header。即出现Header窗口。在此窗口下选择Generalinformation肖像。在GeneralinformationField列表中按一下Date。这时在FieldName的方框中即出现Date方框。可用鼠标器将此方框移动到合适的位置。

可用文字，箭头，方框等工具在Header窗口下增加你感兴趣的内容。

选File，Save。输入Header的名称（如：My_Header〕，按OK，返回到Header窗口。

选File，Exit。即回到ReportPublisher窗口。

在Customize，Footer。即出现Footer窗口。

按一下Generalinformation肖像，在GeneralinformationField列表中按一下PageNumber的方框。将此方框放在报告页面的注脚位置上。

选File，Save。输入Footer的名称(如：My_Footer)，按OK，返回到Footer窗口。

选File，Exit。回到ReportPublish窗口。

在Footer列表中选刚编好的脚标。
·存储报告方法

选File，Save。输入此报告的方法名(如：My_Report)，按OK，返回到ReportPublisher窗口。

选File，Exit。即回到PROJECT窗口。在此窗口下即可看到My_Report报告方法的肖像。

·报告格式预览：报告格式设计好后，在打印之前，可在此预先看到打印效果，如需修改可随时切换到报告出版窗口，边看边修改，直到满意为止。

在PROJECT窗口下，选Result肖像，即出现ResultViewTable表。

在此表上选择需要报告的结果文件，使其变黑。

按一下Preview肖像，即出现ReportMethodSelection窗口。

从目录上选择刚才已建立好的报告方法，按OK。这时即出现刚才所选结果的报告。

在上画面上按NextPage或PrevPage即可看到报告的下一页或上一页。

按方法编辑肖像即可对当前方法进行编辑。

按打印肖像，即可将此报告打印出来。

选择File，Exit。即可退出报告画面，回到“PROJECT”窗口。

6.3.7批量进样结果的处理及打印报告

·当已有确定的处理方法后，可用此方法处理数据。

在ChannelViewTable表中选择你要的样品行并将其按黑。

在Tools下击ProcessandReport肖像。这时即出现ProcessandReportOptions对话框。

在处理方法一栏中选择UseSpecifiedProsessingmethod并指定处理方法，把Print选择框的叉扇掉。按OK。这时开始处理你所选的数据，在屏幕下方显示出ResultGenerator肖像。
按ResultView肖像，处理后的数据即出现在ResultViewTable中。

·打印报告

在ResultViewTable表中选择你要的结果行并将其按黑。
在Tools下按一下打印机肖像，这时出现BackgroundReportGenerator对话框选择你所要用的报告方法，按OK。色谱报告即可打印出来。

6.3.8使用后应填写使用记录(参见附录1)。

6.4.日常维护
6.4.1在每次运行样品组之前需做如下系统维护：
检查并及时更换洗针溶液；用水、甲醇-水（1：1）冲洗系统15-30分钟，再改用流动相来平衡系统；在自动进样器上用手动方式清洗进样器和取样针3-5遍；用洗瓶清洗泵的柱塞杆。
6.4.2在每次运行样品组之后需做如下系统维护：
用水、比例为1：1的甲醇-水或乙腈-水，冲洗系统20-30分钟；在自动进样器上。用手动方式清洗进样器和取样针3-5遍；用洗瓶清洗泵的柱塞杆。
6.4.4.每年由沃特斯公司的维修工程师进行一次大修。

7.参照

《Waters515输液泵操作手册》
《Waters717自动进样器操作手册》
《Waters486紫外检测器操作手册》
《WatersMillennuium32工作站操作手册》
《Waters2690系统操作手册》