离心超滤-离子色谱法检验胃内容物中的亚硝酸盐

【核心介绍】建立了使用离心超滤法对胃内容物检材进行前处理，离子色谱法测定其中亚硝酸盐含量的方法。胃内容物样品经超滤法去除蛋白质及大分子杂质后，使用Ag/H柱除掉干扰组分Cl-，经IonPac AS-19阴离子色谱柱分离，KOH进行梯度淋洗，电导检测器检测。NO2-标准溶液的质量浓度在1.0-200.0 mg/L时线性关系良好,线性方程为Y=0.141X+0.547，相关系数r2=0.999 1，胃内容物中NO2-的检测限为28 μg/g，定量限为86μg/g，回收率在63.7%-81.2%之间。该法灵敏度高，操作简便 　

离心超滤-离子色谱法检验胃内容物中的亚硝酸盐

赵璟悠¹，王勇²，杜鸿雁^3*

（1．苏州市公安局刑警支队，江苏 苏州 215000；2．南京市公安局刑事科学技术研究所，江苏 南京 210012；3．公安部物证鉴定中心，北京 100038）

    摘   要  建立了使用离心超滤法对胃内容物检材进行前处理，离子色谱法测定其中亚硝酸盐含量的方法。胃内容物样品经超滤法去除蛋白质及大分子杂质后，使用Ag/H柱除掉干扰组分Cl^-，经IonPac AS-19阴离子色谱柱分离，KOH进行梯度淋洗，电导检测器检测。NO₂^-标准溶液的质量浓度在1.0-200.0 mg/L时线性关系良好,线性方程为Y=0.141X+0.547，相关系数r²=0.999 1，胃内容物中NO₂^-的检测限为28 μg/g，定量限为86μg/g，回收率在63.7%-81.2%之间。该法灵敏度高，操作简便，重现性好，检验效率高，可满足刑事物证鉴定工作的需要。

    关键词  离子色谱法；胃内容物；亚硝酸盐；电导检测

    中图分类号  O657.7                  

 

Determination of Nitrite in Stomach Contents by Centrifugal Ultrafiltration-ion Chromatography

Zhao Jing-you¹,Wang Yong²,Du Hong-yan³

( 1.Criminal Police Detachment of Suzhou Public Security Bureau, Suzhou 215000,China;2. Institute of Forensic Science and Technology of Nanjing Public Security Bureau,Nanjing 210012,China;3. Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security, Beijing 100038,China)

    Abstract A method for the determination of nitrite in stomach contents by ion chromatography was established. The protein in stomach contents was precipitated with centrifugal ultrafiltration. The Cl^- in the filtrate was removed by a Ag/H column. The filtrate was separated on an IonPac AS-19 column with KOH solution as eluent produced online by an eluent generator (EG). A suppressor with external water mode and a conductivity detector for the detection were used. The linear range of this method was 1.0-200.0 mg/L with a correlation coefficient (r²) of 0.999 1. The limits of detection (LOD, S/N=3) and quantification (LOQ, S/N=10) of nitrite in stomach contents were 28 μg/g and 86 μg/g, respectively. The recoveries range between 63.7%-81.2%. This method is sensitive, simple, accurate, and can meet the needs of public security work.

    Key words ion chromatography; stomach contents;nitrite; conductivity detection

 

亚硝酸盐（Nitrite）广泛应用于化工原料及食品工业中，外观在常态下与食盐相似，故常被人误食或故意投毒而使人中毒。因此，建立一种合适的检测亚硝酸盐含量的方法在法庭科学中具有重要的意义。而胃内容物作为毒物检验中的一种重要检材，对其中亚硝酸盐的定量检验可对毒物摄入路径、摄入量的估测具有一定的参考价值^[2]。

对于胃内容物中亚硝酸盐的定量检验，目前尚未见报道，但血、尿等生物检材中亚硝酸盐的定量检测方法可提供一些参考。亚硝酸盐的检验方法较多，在公安业务实战中采用化学法检验胃内容物中的亚硝酸盐最为广泛，该法通过亚硝酸盐与特定试剂反应所产生的颜色变化来进行定性检验，反应较为灵敏、迅速，满足刑事侦查对于效率的要求，但该法仅可作为定性、快速筛查使用而无法定量。在对生物检材中亚硝酸盐的定量检测方面，离子色谱法^[3-6]得到了越来越广泛的推广和应用，配合超滤法^[7-9]对检材进行前处理，具有较好的重现性和灵敏度。本文的研究结果表明，运用超滤-离子色谱法检测胃内容物中的硝酸根离子，可以满足公安工作的需要。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

    ThermoFisher ICS-3000型离子色谱仪（美国热电公司）；entrifuge 5430型高速离心机（德国艾本德公司）；Millipore Direct Q-5超纯水仪（美国密理博公司）；SK-1型快速混匀器（金坛顺华仪器公司）；entrifuge移液枪，一次性1 mL注射器，有机相性针式滤器（13 mm×0.22 μm），ThermoFisher OnGuardⅡ过滤柱(RP柱、Ag/H柱)，15 mL高速离心管；超滤管（15mL，3KD，美国密理博公司）；NO₂^-标准品（1000mg/L，美国AccuStandard公司）。

1.2 色谱条件

AS-19阴离子分析柱及其配套保护柱（4×250mm），ASRS 500阴离子抑制器（4 mm），抑制电流112 mA，自抑制模式，电导检测器，自动进样，流速1 mL/min，柱箱温度30℃，检测池温度35℃，KOH梯度淋洗，淋洗程序见表1^[3]。

表1 淋洗液的梯度程序

Table 1 Gradient of eluent

Time/min	KOH Concentration/(mmol/L)
0-5	10
5-15	10-45
15-20	45
20.1-23	10

1.3 标准溶液的配制

使用1000mg/L的NO₂^-标准品，用去离子水进行稀释，得到1、10、20、50、100、200mg/L的NO₂^-系列标准溶液。

1.4 样品前处理

准确称取尸体胃内容物1g，置于15mL超滤管中，加入去离子水10mL后振荡、混匀5min，置于高速离心机以7830 r/min的转速离心30 min，取外管内的析出液过经活化的Ag/H柱及0.22μm有机相性针式滤器，弃去3mL初始流出液后开始收集滤液。

2 结果与讨论

2.1除蛋白方法选择

食物的摄入使得胃内容物中通常含有大量的蛋白质，会严重污染色谱柱并干扰检测结果，故须将其去除。最常见的除蛋白方法主要有试剂法及超滤法等，其中试剂法是在含蛋白样品中加入适量的高氯酸、甲醇、乙腈或氯化铵等沉淀剂或变性剂，使蛋白质脱水或生成不溶性盐而沉淀，因需要引入新的物质，易对离子色谱分析产生新的干扰；超滤法适用于与蛋白质等物质的分子量差异较大的目标物分析，相比其他方法，该法具有操作简单，环境友好，不引入其他杂质的优点，因此本研究采用离心超滤法对胃内容物检材进行前处理净化，去除蛋白质等大分子量杂质。

2.2 淋洗方式的选择

淋洗方式通常有等度淋洗和梯度淋洗两种方式，等度淋洗适用于基质比较简单，杂质干扰较少的样品，而胃内容物中食物残渣及各类有机物杂质种类繁多，属复杂基质，若采用等度淋洗则会出现杂质干扰大、邻峰无法分离的情况，故本研究采用梯度淋洗检测NO₂^-。实验表明，该淋洗方式可将胃内容物中的NO₂^-与其他干扰杂质完全分离，见图1。  

图 1 空白添加胃内容物中NO₂^-谱图

Fig.1 Chromatogram of stomach contents spiked with NO₂^- standard

2.3 线性范围、检出限和定量限

实验表明，NO₂^-标准溶液的质量浓度在1-200 mg/L时线性关系良好。使用1.3节中配置的NO₂^-标准溶液进样分析，以NO₂^-的质量浓度（mg/L）为横坐标，测得的峰面积为纵坐标做图，得到NO₂^-线性方程为Y=0.141X+0.547，相关系数r²=0.999 1。采用标准添加法，以信噪比（S/N）为3和10分别计算胃内容物中NO₂^-的检测限为28μg/g、定量限为86μg/g。

2.4 方法回收率和精密度

使用上述配置好的系列NO₂^-标准溶液代替去离子水，按照1.4节步骤进行处理及进样分析，各平行操作5次，得到回收率在63.7%-81.2%之间，精密度在1.7%-3.9%之间。

2.5 实发案件中尸体胃内容物中NO₂^-含量的测定

    2015年3月17日，江苏省某市刘某被发现死在家中，经法医检验尸体符合亚硝酸盐中毒症状。提取死者的胃内容物经本法检验，最终检出NO₂^-含量为484.0mg/g，为本案的最终定性提供了关键的证据。

3 结论

以上的实验研究表明，本文所建立的采用超滤法对尸体胃内容物进行前处理，采用离子色谱法对其中NO₂^-进行检验的方法，相对于文献方法^[6]，本研究引入超滤法对胃内容物样品进行前处理，操作更加简单，而且选择性强，效率高，检测限及回收率均符合要求，并在实发案件中得到验证，可满足刑事毒物分析工作中对NO₂^-的检验需求。

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