【核心介绍】有机酸是动植物代谢过程中重要的中间产物，其含量多寡和变化可反映动植物体应激或胁迫情况下的抗性行为或自我调剂能力，为了进一步了解杨树在逆境中的一系列应激反应与有机酸变化的关系，本文建立了高效液相色谱法测定杨树中的草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和琥珀酸五种有机酸的方法。样品经前处理后，用反相色谱柱，以pH 3.0的3%CH3OH+97%H2O为流动相，流速0.8mL/min，检测波长210nm下进行分离、测定。本方法五种有机酸回收率在94.30%-114.05%之间，定量限在0.007-0.73mg/L之间，相 　

杨树中有机酸的高效液相色谱测定

高茜^,2，韩振泰^1,2*，刘海潮^1,2

（1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091；2. 国家林业局森林生态环境重点实验室，北京 100091）

摘  要 有机酸是动植物代谢过程中重要的中间产物，其含量多寡和变化可反映动植物体应激或胁迫情况下的抗性行为或自我调剂能力，为了进一步了解杨树在逆境中的一系列应激反应与有机酸变化的关系，本文建立了高效液相色谱法测定杨树中的草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和琥珀酸五种有机酸的方法。样品经前处理后，用反相色谱柱，以pH 3.0的3%CH₃OH+97%H₂O为流动相，流速0.8mL/min，检测波长210nm下进行分离、测定。本方法五种有机酸回收率在94.30%-114.05%之间，定量限在0.007-0.73mg/L之间，相对标准偏差为0.3%-0.7%。

关键词 高效液相色谱法；有机酸；杨树

中图分类号 S567.1

Determination of Organic Acids in Poplar by High Performance Liquid Chromatography

Gao Qian^1,2, Han Zhentai^1,2, Liu Haichao^1,2

(1. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. State Forestry Administration Key Laboratory of Forest Ecology and Environment, Beijing, 100091, China)

Abstract: Organic acid is important intermediates in the metabolic processes of plants and annimals. The content of the amount and the change can reflect the dynamic plant stress or stress resistance behavior of self-adjustment ability. In order to further understand the changes of poplar in the face of adversity, a series of stress reaction and organic acid system, the method for the determination of oxalic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid and succinic acids in poplar was established by using high performance liquid chromatography. After pre-treating, the samples were determined on a reverce with 3% CH₃OH + 97% H₂O as mobile phase, flow rate was 0.8ml/min, detection wavelength was 210nm. The recoveries were 94.30% -114.05% and the relative standard deviation was 0.3% -0.7%, the limit of quantitation was 0.007-0.73mg / L.

Keywords: High Performance Liquid Chromatography, Organic acids, Poplar

有机酸参与植物的新陈代谢，在生化反应中常为糖类分解的中间产物。此外，有机酸作为重金属元素的配基可与金属发生络合或螯合作用，形成相对稳定的五元或六元环状结构，从而促进植物对重金属的超积累，在重金属污染与修复中发挥着重要作用^[1,2]。我国是世界上杨树栽培面积最大的国家，有机酸在杨树受到外界环境变化胁迫或处于低磷逆境时会加速分泌，是杨树产生抗逆行为和适应环境进行自我调节的重要标志，因此研究杨树中有机酸的定性与定量分析方法有着重要意义。测定有机酸的分析方法通常有滴定法或返滴定法^[3,4]、薄层色谱法^[5]、原子吸收法^[6]、气相色谱法^[7]、离子色谱法^[8]及高效液相色谱法^[9-11]等，其中，滴定法（包括酸碱滴定法和点位滴定法）仅能测定总有机酸含量；薄层色谱法定量精确性差；原子吸收法常用于测定草酸含量，并不适用于多数有机酸；气相色谱法衍生步骤繁琐，往往用于测定低分子量有机酸；离子色谱法和高效液相色谱法操作简便、准确度高，均可同时测定多种有机酸，但离子色谱仪在国内的普及率不及高效液相色谱仪，且高效液相色谱法主要使用水作为流动相，相较于离子色谱法的淋洗液更为经济环保，应用更为广泛。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695型液相色谱仪，2487紫外检测器，Empower工作站，Thermo ODS HYPERSIL柱（4.6×200mm，5µm），超声波振荡器，高速离心机。草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和琥珀酸的标准品均为美国Sigma公司产品，甲醇为色谱纯试剂，磷酸为分析纯试剂，水为18.2MΩ的超纯水（英国ELGA公司）。

1.2试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别称取五种有机酸标准品10.0mg至25mL容量瓶中，用少量水溶解，超声波震荡至完全溶解，加水定容至刻度，摇匀，该溶液中各有机酸的浓度均为0.4mg/mL。

1.2.2 色谱条件

柱温：30℃；检测波长：210nm；流动相：3%CH₃OH+97%H₂O，用磷酸调节pH=3.0；流速0.8mL/min；进样量20μL

1.2.3 样品的制备

称取500mg新鲜杨树组培苗，加入10mL去离子水，75℃水浴20min，中间不时震荡，冷却至常温后，13000g离心10min，收集上清液。随后向沉淀中加入3mL提取液，震荡混匀后，同上离心，合并上清液，冷冻干燥后复溶于1mL去离子水，过0.22µm水系滤膜待用。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

进行实验前选择三种前处理方法对样品进行制备比较其处理效果，即分别选择80%的乙醇，0.5mol/L的 HCL溶液和去离子水对样品进行提取，经比较可得，80%的乙醇提取效果不佳，0.5mol/L HCL溶液和去离子水提取效果理想，最终选择去离子水作为前处理提取溶剂。

2.2 流动相的选择

为了使五种有机酸更好的分离，我们选择纯水和不同比例的甲醇水做流动相，结果3%CH₃OH+97%H₂O，用磷酸调节pH=3.0时，五种有机酸达到基线分离并避免了杂质峰的干扰，且峰的对称性也很好。

2.3 样品的测定

取20μL标准溶液在上述色谱条件下进行色谱分析，得到五种有机酸的标准溶液色谱图（图1）。重复进样三次，求各标样的峰面积平均值，在同一色谱条件下，取样品溶液20μL进样得样品溶液色谱图（图2），重复进行三次，求峰面积平均值，外标法计算。

图1 有机酸混合标准品色谱图

图2 杨树样品色谱图

2.4 标准曲线及线性范围

分别取有机酸混合标准溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL和30 μL，在上述色谱条件下进行色谱分析，各有机酸的实际进样量分别为：2μg、4μg 、6μg.…12μg，以进样量与峰面积作标准曲线，得到标准样线性方程及相关系数（见表1），五种有机酸的标准曲线相关系数均达到0.9999以上，各标准曲线呈良好线性关系

表1 五种有机酸标样保留时间、峰面积及标准曲线

组分	保留时间（min）	标准曲线	相关系数
草酸	2.891	y=6.977037e+005x-1.606541e+005	0.9999
酒石酸	3.372	y=1.163608e+005x-2.332973e+004	0.9999
苹果酸	3.909	y=5.987007e+004x-1.391797e+004	0.9999
柠檬酸	6.302	y=7.983015e+004x-1.373856e+004	0.9999
琥珀酸	6.639	y=4.468648e+004x-5.514559e+003	0.9999

2.5 方法回收率及检出限

取6份等量样品，其中3份加入有机酸标准, 按照1.2.3中方法制备样品溶液进行测定，计算有机酸的回收率，在选定的色谱条件下，以噪音的3倍峰高对应的有机酸含量为检测限，计算五种有机酸的最小检测限，以噪音的10倍峰对应的有机酸浓度计算定量限。相关结果见表2。

表2 5种有机酸的加标回收率

组分	本底值（µg）	加标量（µg）	测定值（µg）	平均回收率（%）	检出限（mg/L）	定量限（mg/L）
草酸	72.06	118.00	196.70	105.63	0.002	0.007
酒石酸	43.78	269.00	350.58	114.05	0.19	0.63
苹果酸	443.60	265.00	715.02	102.42	0.14	0.47
柠檬酸	93.18	282.00	359.12	94.30	0.22	0.73
琥珀酸	45.36	214.66	257.10	98.64	0.16	0.53

2.6 精密度

将五种混合标准溶液连续进样6次（浓度为1.0g/L），每次进样20μL，计算相对标准偏差RSD值（见表3）。

表3 5种有机酸的精密度试验（n=6）

组分	峰面积1	峰面积2	峰面积3	峰面积4	峰面积5	峰面积6	平均值	RSD（%）
草酸	6809295	6853183	6867935	6881907	6885011	6881673	6863167	0.4
酒石酸	1511826	1511236	1522813	1519892	1519836	1517029	1517105	0.3
苹果酸	654619	655416	658275	659387	660664	660454	658135	0.4
柠檬酸	736454	741610	744941	749692	748670	750003	745228	0.7
琥珀酸	382084	380674	382026	377847	381080	378966	380446	0.4

3 小结

对杨树中的有机酸进行测定，使用去离子水作为前处理提取溶剂最简单有效，以3%CH3OH+97%H2O为流动相，用磷酸调节pH=3.0，测定波长为210nm，分离效果最佳。应用本方法测定，前处理简单，过程损失较少，回收率稳定，五种有机酸的回收率在94.30%-114.05%之间，相对标准偏差RSD%＜5，能够满足对杨树中有机酸含量的检测要求。

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