液相色谱-串联质谱法测定液体乳制品中7种激素残留

【核心介绍】建立了液相色谱-串联四极杆质谱同时测定液体乳制品中雌二醇、雌三醇、雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮7种激素残留的快速测定方法。采用甲醇提取液体乳制品中待测定组分，提取液经离心、C18固相萃取柱净化、甲醇洗脱。在正、负电喷雾离子化多反应监测模式下检测7种激素，采用ZORBAX SB-C18(2.1×100 mm,3.5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液,外标法定量。在该优化条件下，7种激素定量限（S/N≥10）为1 µg/kg～20 µg/kg ,方法回收 　

液相色谱-串联质谱法测定液体乳制品中7种激素残留

万春花  张云伟 黄优生 鄢 兵 胡海山 刘廷华 熊文生

（江西省分析测试研究所，江西南昌 330029）

摘  要 建立了液相色谱-串联四极杆质谱同时测定液体乳制品中雌二醇、雌三醇、雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮7种激素残留的快速测定方法。采用甲醇提取液体乳制品中待测定组分，提取液经离心、C₁₈固相萃取柱净化、甲醇洗脱。在正、负电喷雾离子化多反应监测模式下检测7种激素，采用ZORBAX SB-C₁₈(2.1×100 mm,3.5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液,外标法定量。在该优化条件下，7种激素定量限（S/N≥10）为1 µg/kg～20 µg/kg ,方法回收率为77.2 %～89.6 %，相对标准偏差（RSD）为3.61%～8.49%。经测定多种市场上销售的液体乳制品，表明该方法操作简单、测定结果准确，可以用于液体乳制品中多种激素残留的快速测定。

关键词: 液相色谱-串联质谱；固相萃取；激素；液体乳制品

中图分类号: O657.63                                                   

 

Determination of Seven Residual Hormones in Fluid Dairy Products by Liquid Chromatography-tandem  Mass  Spectrometry

Wan Chunhua  Zhang Yunwei  Huang Yousheng  Yan Bing  Hu Haishan  Liu Tinghua  ,Xiong Wensheng

(Jiangxi Institute of Analysing and Testing , Nanchang 330029, China)

Abstract: A methodology has been developed to rapidly quantify the residues of seven hormones in fluid dairy products by liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (LC-MS/MS), including estradiol, estriol, estrone, diethylstilbestrol, dienestrol, hexestrol and progesterone, etc. The lipids in the samples were extracted using methanol, centrifuged and purified on a C₁₈ solid-phase extraction columns with methanol as the elution solvent. The analysis of the seven analytes was carried out using LC-MS/MS on a ZORBAX SB-C₁₈ column with the MS detector in positive and negative electrospray multi-reaction monitoring mode. For negative ESI mode, Acetonitrile-5mmol/L ammonium acetate solution was used as mobile phase while Acetonitrile-0.1% formic acid solution was used as mobile in the positive ESI mode. The quantification was based on external standards. At these optimal conditions, the limits of quantification (S/N≥10) were 1 µg/kg～20 µg/kg. The overall recoveries varied from 77.2% to 89.6%, and the relative standard deviations were between 3.61% and 8.49%. Tests on commercial fluid dairy products demonstrated the simplicity and accuracy of this methodology, which can be used for determining the residual hormones in fluid dairy products.

Key words: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; solid phase extraction; hormones; fluid dairy products

 

在奶牛的正常生长过程中会产生雌激素（雌二醇、雌三醇、雌酮）和孕激素（孕酮），这些内源性激素是对人体无害的，但在奶牛饲养过程中常用激素来促长、催乳、催产，有的甚至违规使用低成本的人工合成激素已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚等，这些外源性禁用激素残留随原乳带入到各类乳

制品中，被人体摄入后在体内积累危害健康，严重的会致畸、致癌，世界卫生组织禁止使用己烯雌酚、己烷雌酚作为动物的生长促进剂。我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定：苯甲酸雌二醇允许做治疗用，但不得在动物性食品中检出，禁止使用已烯雌酚及其盐、酯；农业部公告第 176 号禁止在饲料和动物饮用水中使用己烯雌酚、雌二醇等性激素。

目前，激素检测的常用方法主要有液相色谱法（HPLC）^[1-2]、气质联用法（GC-MS）^[3-5]、液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS) ^{[6-10 ]}，HPLC法灵敏度低，GC—MS需要复杂的的衍生化过程；而LC-MS-MS具有选择性好、灵敏度高，定性定量准确等优点。

近年来,乳粉激素事件频繁发生引起了人们对激素残留的重视，乳制品中的液体乳制品因方便食用而倍受大众青睐。但目前国内尚无乳及乳制品中内外源激素残留的专用检测标准，只有动物性食品中多激素检测标准^{[6-7 ]}和牛奶和奶粉中己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚等外源性激素的检测方法^[8]，因而建立一种同时测定液体乳制品中内外源激素的方法就显得尤为重要。本实验通过研究优化激素的同时提取、净化条件，以及色谱分离条件，建立了LC-MS-MS快速测定液体乳制品中7种激素的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(配有G1312B超高压二元梯度泵、G1367C性能自动进样器、G1316智能柱温箱)、Agilent 6410高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪[配有电喷雾电离源(ESI)]（美国Agilent公司）,HC-3514高速离心机（科大创新股份有限公司）,DC-12氮吹仪（上海安谱科学仪器厂）,XH-B型涡旋混合器（江苏康健医疗用品有限公司）,Milli-Q去离子水制备系统（美国Millipore公司），KQ－5200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），AL204型电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

雌二醇、雌三醇、雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮（分析标准品，德国Dr. Ehrenstorfer公司）；乙腈（色谱纯，Tedia公司，批号：13035054）；甲醇（色谱纯，Sigma-Aldrich公司，批号：WXBC1598V）；水为超纯水；液体乳制品均购自超市。CNWBOND NH2SPE小柱（500 mg，3 mL），CNWBOND LC-C₁₈ SPE小柱（500 mg，3 mL），Poly-Sery HLB SPE小柱（60 mg，3 mL），Poly-Sery HLB SPE小柱（60 mg，3 mL）。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱: ZORBAX SB-C₁₈柱(2.1×100 mm,3.5 µm）；流动相：乙腈(A)与水(含0.1%甲酸或5mM乙酸铵)(B)；梯度洗脱程序：O一1min，30％A-80％A；1～3 min，80％A；3—3.1 min，80％A一10％A; 3.1—8 min，10％A；流速：0.3 mL／min；进样量：5µL；柱温：40℃。

1.2.2 串联质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI)；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10L/min；雾化气压力：40psi；毛细管电压：4000V；电子倍增管电压：300V；每种化合物的离子源模式、母离子、子离子、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 质谱参数

注：*为定量离子

1.2.3 标准溶液的配制

分别准确称取雌二醇、雌三醇、雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮标准品10 mg于50 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为0.2 mg/mL的混合对照品储备液，在4 ℃冰箱中避光保存。使用时，吸取储备液1 mL于20 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，制备成10.0 µg/mL的标准工作液。

1.2.4 样品处理

称取5克样品置于50 mL带螺旋盖的聚丙烯离心管中，加入20 mL甲醇，涡旋混匀1 min，以3500 r/min的转速离心5 min，残渣再加10 mL甲醇重复提取一次，合并上清液，于50 ℃真空浓缩近干，加入1 mL甲醇超声溶解，加10 mL水，过C₁₈SPE小柱，用3 mL10%甲醇淋洗，5 mL甲醇洗脱，10mL比色管收集洗脱液，50 ℃水浴氮气吹干，加入1 mL 50%乙腈水溶液，涡旋溶解，经0.22 µm滤膜过滤后，滤液供LC-MS／MS测定。

2  结果与讨论

2.1 固相萃取净化条件的选择

采用固相萃取净化时，待净化溶液的组成会影响回收率和净化效果。甲醇比例高，一些相对强极性目标物不能保留在固相萃取柱上；甲醇比例低，弱极性杂质易被保留，柱容量超载，目标物不能定量保留。本实验分别用60％甲醇、50％甲醇、40％甲醇、30％甲醇、20％甲醇、10％甲醇和水溶解样品残渣后采用固相萃取柱净化，结果表明，上样溶液中甲醇含量低于30％时，7种激素能完全保留在固相萃取柱中。为了保证所有目标物均能保留在固相柱中，选用20％甲醇作为上样液。实验筛选了CNWBOND  LC-C18 SPE小柱（500 mg,3 mL）、Poly-Sery HLB SPE小柱（60 mg,3 mL）、CNWBOND NH₂ SPE小柱（500 mg,3 mL）、石墨化碳黑小柱对加标后液体奶的净化效果及回收率，前两种小柱的性能较好，本实验采用CNWBOND LC-C18 固相萃取小柱来净化样品。

2.2 质谱条件的优化

采用1µg／mL单标准溶液进行母离子全扫描，根据各化合物的结构性质不同，孕酮采用正离子模式，已烯雌酚、双烯雌酚、雌二醇、雌三醇、雌酮、己烷雌酚采用负离子模式，确定各化合物的母离子。再对待测物的母离子，进行子离子扫描，选取丰度较强、干扰较小的两个子离子作为定性与定量离子，优化得到的质谱参数见表1。

2.3 色谱条件的优化

已烯雌酚、双烯雌酚、雌二醇、雌三醇、雌酮、己烷雌酚采用负离子模式检测，为了促进化合物的离子化，提高质谱检测的灵敏度，在流动相中加入适量的乙酸铵，采用乙腈-水(含5mmol/L乙酸铵)作为流动相进行色谱条件的优化。孕酮采用正离子模式检测，加入适量的甲酸则有利于提高质谱检测的灵敏度，采用乙腈-水(含0.1%甲酸)作为流动相进行色谱条件的优化。两种模式，均采用梯度洗脱的方法，可以获得较好的实验结果（图1）。

图1 激素混合标准溶液多反应监测（MRM）色谱图

注：自上而下依次为雌三醇、雌二醇、雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚、孕酮

 

2.4 方法的检出限与线性关系

用流动相逐级稀释标准品母液，得一系列浓度的标准品溶液，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，作标准曲线，考察峰面积与浓度的线性关系，以10倍信噪比对应浓度换算为定量限。结果表明，7个组分的峰面积y与质量浓度x呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9995，检出限为1 µg/kg～20 µg/kg，结果见表2。

表2 线性关系和检出限

 

2.5 方法的回收率与精密度

称取空白酸奶样品进行标准添加实验，加入一定量的混合对照品溶液，按1.2.4项下处理后，平行测定6次（见表3）。7种激素的回收率为77.2%～89.6%，相对标准偏差(RSD)为3.61%-8.49%。

表3 样品加标回收率结果(n=6)

2.6 实际样品的测定

采用本方法对24种市售液体乳制品进行了激素含量的测定。经测定，选购的16个样本中均含有孕酮(1.4～32μg／kg)，2个样品中检出已烯雌酚(7μg／kg)，其他激素均未检出。

3  结论

建立了一种可以准确测定液体乳制品中多种激素的分析方法。结果表明，本实验快速、简便、准确、灵敏，能够完全满足日常样品检测。

 

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