反相高效液相色谱法测定人血浆中利鲁唑浓度

摘要：目的：建立测定利鲁唑血药浓度的方法。方法：采用反相高效液相色谱法，以Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱。甲醇-0.03mol／L磷酸二氢铵(80：20，V／V)为流动相，乙醚为提取剂，流速为0.8ml／min，检测波长为265nm：结果：利鲁唑检测浓度线性范围为5～1 000ng／ml，最低检测浓度为5ng／ml；高、中、低3种浓度的回收率分别为99.51％、95.74％和97.12％．日内RSD≤1.17％、日间RSD≤6.48％(n=5) 结论：本方法灵敏、准确、简单、快速，可用于人体药动学研究。 
关键词：利鲁唑；血药浓度；反相高效液相色谱法 
利鲁唑(Riluzole，RLZ)是一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)的新药，不仅是第一个获美国和欧盟批准用于治疗ALS的药物，也是至今国内唯一获准用于ALS治疗的药物。其血样检测方法国内未见文献报道，国外采用液质联用检测法和高效液相色谱法，并多采用同相萃取法提取药物。笔者在此建立了以液相萃取法提取药物(乙醚为提取剂)的反相高效液相色谱法(RP—HPLC)测定人血浆中RLZ浓度的方法。 
1 材料 
1．1 仪器 
P230液相色谱仪，包括DAD230二级管阵列紫外检测器、AS230 自动进样器、EC2000色谱化学工作站(美国惠普公司)；Diamonsil C18色谱柱(美国迪马公司，250mm×4.6mm，5μm)；漩涡混合器(上海医科大学仪器厂)；电子天平(瑞士Sartorius)；12-24型微量高速离心机(美国IEC公司)；真空干燥箱 
(德围MMM 公司)。 
1．2 药品和试剂 
RLZ片剂(力如太，Aventis制药公司)；RLZ对照品(北京万全药物技术有限公司，批号：030422，含量>99.3％)；内标物β-萘酚(北京瀛海精细化工厂，批号：990113，含量>99.5％)；甲醇(色谱纯，美国迪马公司)；水为超纯水，其余均为分析纯。 
1．3 对照品和内标溶液 
准确称取RLZ100.0mg，加入甲醇溶解并定容至100ml，置于冰箱4℃避光保存，临用时用甲醇稀释成所需浓度的RLZ对照品溶液 内标溶液：β-萘酚浓度为20μg／ml的甲醇溶液。 
2 方法与结果 
2．1 色谱条件 
色谱柱：Diamonsil C18反相柱；流动相：甲醇一0.03mol／L NH4H204(80：20，V／V)；流速：0.8ml／min；柱温：40℃；紫外检测波长：265nm；满标吸光度值(AUFS)：0.01。 
2．2 样品处理方法 
取0.4ml含药血浆，置于2.0ml锥形离心管中，加入浓度为20μg／ml的β-萘酚20μl，快速振荡数秒，加入1.2ml乙醚，密塞，旋转振荡40s，12000r／min离心3min，吸取有机层，置于1.5ml锥形离心管中，32℃真空干燥至干。进样前加入60μl甲醇溶解，快速振荡数秒溶解残渣，吸取15μl进样。 
2．3 标准曲线的制备 
取20名健康志愿者0．4ml空白血浆9份，分别加入不同浓度的RLZ对照品溶液，振荡数秒，使血浆药物浓度相当于0、5、10、25、50、100、250、500、1000ng／ml，按“2．2”项下方法处理。经RP-HPLC分析，以测得的RLZ峰面积与内标峰面积之比(X)为横坐标，以血浆RLZ浓度(Y)为纵坐标，得到RLZ检测浓度线性范围为5～1000 ng／ml。回归方程Y=3.26X+3.46，r=0.9999。当R=3时，最低检测浓度为5ng／ml。β-萘酚和RLZ的保留时间分别为5.5min、6.2min，理论塔板数>3000，分离度>4，拖尾因子=9.52-1.41。 
2．4 回收率及精密度试验 
取高、中、低3种浓度(500、250、50ng／m1)，分别制作提取前、后的两组样品，经色谱分析，比较峰面积，得到的提取回收率均大于90％。按“2．3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度样品，在1d内重复5次和在2wk内重复5次测定其浓度，计算日内、日间相对标准差及相对回收率。 
2．5 稳定性试验 
按“2．3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度的3组共18个样品(双样)，置于一20℃下冻存，1wk、3wk后分别进行色谱测定。结果，与放置前比较，未见冻存样品的药物浓度降低。 
2．6 质控样品的制备和控制方法 
按“2．3”项下方法分别配制中浓度(250ng／m1)36个血浆样品(一式9份)，置于一20℃冻存，备用，此即为质控样品。每天检测血样品前须先检测质控样品，如果质控样品相对回收率均在85％～115％内时，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。 
2．7 临床应用 
20名健康男性志愿者单次口服RLZ lOOmg片后分别于0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、3、4、6、8、10、12、16、24h取静脉血5ml，按“2．2”项下方法进行色谱分析，经3p97程序进行模型拟合，药一时曲线符合二室线性动力学模型，其药动学参数，平均血药浓度一时间曲线。 
3 讨论 
笔者在190nm～400nm波长范围内对样品溶液进行紫外扫描．发现在225nm和265nm处均有一吸收峰，与文献报道相似，故选择265nm为检测波长。 
笔者试用甲醇一水为流动相，配制两者不同比例的混合液后均发现RLZ峰前倾，出峰时间早，峰形对称性差；用0.3mol／L的乙酸铵代替水后，峰结果对称性好，出峰时间推迟，但灵敏度不高；用0.03mol／L的磷酸二氢铵代替乙酸铵后，结果峰形对称性好，检测限也低；再改变与甲醇的配比发现，当两者体积比为(80：20，V／V)、流速为0.8ml／min、柱温为40℃时出峰时间理想，故采用此色谱系统。 
笔者分别使用乙醚、正己烷、乙酸乙酯和氯仿为提取剂提取血浆中药物，经过比较发现，正己烷提取率最低，乙醚的提取率最高，故采用乙醚作为提取剂。国外文献中提到的内标物在国内很难得到，经过对卡马西平、苯妥英钠、β-萘酚、地西泮等物质或药物进行比较，笔者发现β-萘酚作内标物较理想，在乙醚中提取率高，与RLZ能完全分开且不发生相互作用。在试验中，笔者发现，空白血浆在内标出峰处有一杂质峰，但由于该杂质峰峰高和峰面积与内标物比较均很小，不会对RLZ的浓度测定产生影响。采用乙醚一次性提取后用甲醇定容，进行紫外色谱分析，所取血浆量仅为0.4ml、进样量仅为15μl便可达到实验要求，既提高了灵敏度又减少了样品杂质，保证色谱柱能进行大量样品的连续分析。本实验操作过程简单、快速，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，可以作为临床常规RLZ的血药浓度监测及其药动学的研究。