反相高效液相色谱法测定罗哌卡因的血药浓度

摘要：
目的 建立了人血浆中罗哌卡因浓度的RP-HPLC测定法。
方法 以布比卡因为内标，甲醇：水（200：100v/v）为流动相。紫外检测波长为210nm。
结果 罗哌卡因与内标分离良好，血浆中罗哌卡因平均回收率为97%，日内、日间RSD小于10%，血浆罗哌卡因浓度在0.25-4μg/mL范围内线性关系良好，r=0.9996。
结论 该方法操作简便、结果可靠，适用于罗哌卡因的血药浓度测定。
关键词：罗哌卡因 血药浓度 RP-HPLC

    盐酸罗哌卡因（Ropivacaine HCL）是一种新型局部麻醉药，与布比卡因相比罗哌卡因具有更高的安全性以及更广的高、低浓度之间的临床使用范围。罗哌卡因的血药浓度测定国内报道很少，采用高效液相色谱法测定罗哌卡因的血药浓度国内还未见报道。我们建立了一种简便、快速的人血浆中罗哌卡因的反相高效液相色谱测定方法，并对无痛分娩孕妇的脐带血进行了血药浓度测定，以期为临床安全用药提供依据。
1 材料方法
1.1 仪器、药品及试剂
　　依利特高效液相色谱系统，包括P200泵，UV200紫外检测器，EC2000工作站；旋涡混合器；超声波仪；离心机；罗哌卡因（瑞典阿斯特拉公司）；色谱甲醇 
1.2 标准溶液及内标溶液的配制
　　精密吸取罗哌卡因（7.5mg/mL）670μL，置于50mL的容量瓶中，加水至刻度，配成浓度为100μg/mL的罗哌卡因溶液；再从容量瓶中吸取4mL的溶液置于50mL的容量瓶中，加水至刻度，配成浓度为8μg/mL的罗哌卡因溶液，置于4℃的冰箱中保存。
　　精密吸取布比卡因（0.75%）670μL置于50mL的容量瓶中，加水至刻度，配成浓度为100μg/mL的内标储备液，置于4℃的冰箱中保存。
1.3 色谱条件
　　色谱柱：Waters公司SymmetryC18柱；紫外检测波长210nm；流动相为甲醇-水（200：100v/v）用乙二胺、冰醋酸调pH为7.45；流速1.0mL/min。
1.4 样品预处理
　　取待测血浆0.5mL，加入内标液（含布比卡因100μg/mL）15μL，混匀，再加入甲醇1.5mL，旋涡混合1分钟，4000r/min离心10分钟，吸取上清液过滤，20μL进样。
2 结果
2.1 血浆中标准曲线的制备
　　取6支10mL的具塞离心试管，分别加入血浆0.5mL，再分别加入浓度为0、8、4、2、1、0.5μg/mL的罗哌卡因溶液500μL，旋涡混合；分别加入内标溶液15μL，混合均匀后6支试管分别加入甲醇1.5mL，旋涡混合，4000r/min离心10分钟，吸取上清液过滤，20μL进样。以罗哌卡因与内标的峰面积比对罗哌卡因浓度进行拟合，得回归方程为Y=0.3062X-0.02979，r=0.9996（n=5）。线性范围0.25-4μg/mL，最小检测浓度0.25μg/mL。
2.2 回收率、精密度实验
　　罗哌卡因在0.25、1.0、4.0μg/mL三个浓度水平进行回收率和精密度实验。日内精密度按上述3个浓度各5管在同1d按"样品预处理"操作，日间精密度按上述3个浓度各5管在2wk内不同天间检测，其平均回收率在82.3%，RSD小于8%。
2.3 血药浓度测定
　　8例分娩妇女，年龄22-28岁，体重45-70kg，无痛分娩时罗哌卡因浓度为0.375%，分娩后立即取脐带血测定血药浓度，其平均血药浓度在0.85μg/mL。
3 讨论
　　流动相的pH值在保留时间，罗哌卡因和内标的分离以及样品峰、内标峰与杂质峰的分离上显得很重要。在配制时首先按照甲醇:水:乙二胺:冰醋酸200:100:0.3:0.3配成溶液，测定其pH值，再用乙二胺或冰醋酸调pH至7.45±0.05。
　　文献[1][2][3][4]报道采用二氯甲烷、乙醚和氯仿作为提取相，即先在血样中加入碱，使罗哌卡因和内标成为有机游离物，再用有机相提取，有机溶液在氮气下吹干，最后用少量流动溶解进样。经过实验发现二氯甲烷和氯仿的乳化严重而且破乳困难，难以分离，而用乙醚的提取回收率很不稳定；改用乙酸乙酯提取可以很好的消除乳化现象，回收率也较稳定，但是样品峰、内标峰和杂质峰的分离度不高，多次改变流动相的配比和pH值（6.70-7.80）均没有收到很好的效果。最后改用醇沉的方法，方法简便，没有乳化，样品峰、内标峰和杂质峰的分离度高，回收率高而且稳定，但要求检测限较高。
　　在内标选择上，参照HPLC测定布比卡因的文献[2][3][4]采用利多卡因为内标，但内标峰和杂质峰难以分离，调整流动相配比和pH值均未收到很好效果。最后采用了罗哌卡因的同系物布比卡因作为内标，发现在内标和罗哌卡因、杂质峰的分离，内标的保留时间表现的都很好。