反相高效液相色谱法测定复方甘草甜素片三组分的含量

摘要：目的：建立测定复方甘草甜素片中甘草酸单铵盐及两种氨基酸含量的方法。方珐：采用RP-HPLC法测定复方甘草甜素片三组分的含量。流动相为乙腈：0.025 mol／L NaAC-DMF(4O：60，v／v)，固定相为ZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，双波长检测，检测波长256nm和360nm。结果：甘草酸单铵盐在4Oμg／ml～300μg／ml范围和两种氨基酸在20μg／ml～120μg／ml范围线性相关良好(r=0.9996，r=0.9997．r=0.9998)，回归方程为Y=14318X+724.64．Y=265416X，Y=142768X一5023，平均回收率分别为98.41%(RSD=1.8O％)、101.36%(RSD=1.2O%)和101.56%(RSD=2.O5%)。结论：HPLC法测定复方甘草甜素片中三组分简便、准确、重现性好，可作为该制剂质量检验的定量方法。 
    关键词：复方甘草甜素片；高效液相色谱法；甘草酸单铵盐；甘氨酸；蛋氨酸；含量测定 
    复方甘草甜素制剂(商品名：美能；英文名：Stronger Neo—minophagen，SNMC)于1948年在日本生产面市，2O世纪8O年代正式报道作为治疗慢性肝炎的制剂应用于临床。美能片处方由甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸组成，用于治疗慢性肝病，可改善肝功能，具有细胞膜保护作用，疗效确定，用药安全，临床应用广泛。美能中甘草酸单铵盐、甘氨酸、DL-蛋氨酸的含量测定分别采用HPLC法、薄层色谱法和反滴定法，操作步骤较为繁杂，本研究依据文献和实验摸索确定使用RP-HPLC法测定本品中甘草酸单铵盐及两种氨基酸的含量，具有样品前处理操作简单、保留时间短、分离度较好的优点，结果显示该法准确、重现性好，可作为本品的质量控制标准。 
    l 仪器与试药 
    1．1 仪器岛津UV-2401紫外一可见分光光度计；P230高效液相色谱仪；BP21ID精密天平(日本AND)；Hitech超纯水机；pHS-3型精密pH计(上海精科雷磁仪器厂)；GB11240-80型恒温水浴锅。 
    1．2 药品试剂 复方甘草甜素片(日本美能发源制药公司制造，批号：9O9O2B)；甘草酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0731—200205)；甘氨酸对照品(西安化学试剂厂，批号：900723)；蛋氨酸对照品(上海试剂三厂，批号：920211)；乙腈系色谱纯，2，4-二硝基氟苯(DNFB)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)及其它试剂均为分析纯；水为双蒸水。 
    1．3 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈：0.025mol／LNaAC-DMF(4O：60，v／v)；流速1ml／min ；柱温35℃ ；检测波长：甘草酸256nm，氨基酸360nm；进样量2Oμl。 
    2 方法与结果 
    2．1 甘草酸单铵盐的含量测定 
    2．1．1 对照品溶液的配制 精密称取甘草酸单铵盐对照品0.00505g，置1O ml量瓶内，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 ml含505μg的甘草酸单铵盐)。甘草酸单铵盐的保留时间约为4.4min。 
    2．1．2 标准曲线及线性范围 分别精密吸取对照品溶液配制成浓度为16.16ng／ml、40.40ng／ml、8O.80ng／ml、1.01μg／ml、5.05μg／ml、20.20μg／ml、4O.4Oμg／ml、101μg／ml、202μg／ml、303μg／ml的溶液，取样注入液相色谱仪，按上述色谱条件操作，以进样浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，求得回归方程为：Y=14318 X +724.64，r=0.9996。试验结果表明：甘草酸单铵盐的进样量在40 ng／ml～300μg／ml范围内线性关系良好。 
    2．1．3 回收率试验精密称取已知含量的产品，分别加入一定量的甘草酸对照品，配制成高、中、低3种浓度，进样测定，计算回收率为98.41%，RSD=1.80 。 
    2．1．4 精密度试验取线性范围内的高、中、低浓度溶液，平行操作测定6次，每次进样2Oμl，测得日内精密度RSD=1.82%(n=6)；连续测定5d，日间精密度RSD=2.92%(n=5)。 
    2．1．5 样品含量测定 取复方甘草甜素片2O片去糖衣，研细，精密称取约0.5g，置5O ml容量瓶中，加入蒸馏水适量，超声提取30min，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取此溶液2Oμl进样测定，记录峰面积，以外标法进行计算。样品溶液色谱图。 
    2．2 两种氨基酸的含量测定 传统的氨基酸测定分析手段主要采用氨基酸分析仪，该仪器对氨基酸测定的专属性强，但仪器昂贵且不能广泛用于其他类型样品的测定。由于大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，常需将氨基酸先衍生化再测定。原理为氨基酸在碱性溶液中能定量地与2，4-二硝基氟苯(DNFB)迅速缩合而成二硝基苯氨基酸(DNP-氨基酸)，该衍生化产物可采用紫外检测器检测。 
    2．2．1 最优衍生化条件 利用单因素考察和正交实验筛选最优衍生化条件，以衍生化时间、温度、衍生剂用量三因素对衍生反应的影响，筛选出最优化衍生化条件：60min，60℃，DNFB：氨基酸=7：1(摩尔比)。 
    2．2．2 对照品溶液的配制 分别精密称取甘氨酸与蛋氨酸对照品0.05039g和0.05053g，置10ml容量瓶内，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。取4ml此液置50 ml容量瓶内，加入0.05 mol／L NaHC03 4 ml、2 DNFB26.32ml，置60℃ 水浴锅中暗处加热60min后，以KH2PO4缓冲液定容，混匀，得储备液(甘氨酸403.12μg／ml，蛋氨酸404.24μg／m1)。甘氨酸和蛋氨酸的保留时间分别约为4.16min和6.8min。 
    2．2．3 标准曲线及线性范围 分别精密吸取对照品溶液，配制成甘氨酸浓度为8.06ng／ml、20.16ng／ml、60.47ng／ml、1.01μg／ml、20.16μg／ml、40.31μg／ml、80.62μg／ml、120.94μg／ml；蛋氨酸浓度为8.08ng／ml、20.21ng／ml、60.64ng／ml、1.O1μg／ml、20.21μg／ml、40.42μg／ml、80.85μg／ml、121.27μg／ml，取样按上述色谱条件操作，以进样浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，求得甘氨酸回归方程为：Y=265416 X ±724.64(r=0.9997)；蛋氨酸回归方程为：Y=142769 X一5023(r=O.9998)。试验结果表明：两种氨基酸的进样量在20ng／ml～120μg／ml范围内线性关系良好。 
    2．2．4 回收率试验精密称取已知含量的产品，分别加入一定量的甘氨酸与蛋氨酸对照品，配制成高、中、低3种浓度，按对照品溶液测定项下处理，进样测定含量，计算回收率为：甘氨酸101.36%，RSD=1.2O%；蛋氨酸101.56%，RSD=2.05%。 
    2．2．5 精密度试验取线性范围内的高、中、低浓度溶液，平行操作测定6次，每次进样20μl测得日内精密度：甘氨酸RSD=0.62%，蛋氨酸RSD=1.04%；连续测定5d，日间精密度：甘氨酸RSD=3.14%，蛋氨酸RSD=3.93%。 
    2．2．6 供试品溶液的制备取复方甘草甜素片2O片去糖衣，研细，精密称取约0.025g，置25ml容量瓶中，加入蒸馏水适量，超声提取30min，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，取此溶液4ml置10ml容量瓶内，按对照品溶液测定项下处理后，取样测定，记录峰面积，以外标法进行计算。对照品溶液与样品溶液色谱图见图3。6批样品中甘氨酸与蛋氨酸的含量测定。 
    3 结论 
    3．1 按本法对甘草酸及两种氨基酸在同一系统适用性条件下使用双波长进行液相色谱分析，回收率和线性相关系数良好，操作简便、准确、重现性好、测定迅速，适用于该产品的质量控制，可作为质量检验的定量方法。 
    3．2 本法采用的衍生化试剂用量少，衍生化反应易于控制，制得的DNP-氨基酸性质稳定，与氨基酸的定量关系明确，不需专用仪器设备即可分离测定两种氨基酸。