HPLC测定血浆中尼美舒利浓度
摘要 目的：建立测定血浆中尼美舒利(Nim)的反相高效液相色谱法。方法：血浆样品用甲醇沉淀蛋白，经酸化后加甲苯提取，氮气挥干，加流动相溶解进样。以YWG-C18柱，甲醇-0.05 mol*L-1磷酸二氢钾(55∶45)为流动相，pH 5.02，甲苯磺丁脲为内标，在波长230 nm处检测。结果：在0.26 μg*ml-1～10.8 μg*ml-1浓度范围内，峰面积比与浓度呈良好线性关系，r=0.999 5。最低检测限为0.2 μg*ml-1，方法重现性好，方法回收率为86.0%～92.2%，萃取回收率为72.2%～88.4%。结论：用本方法测定8例单剂量po 100 mg Nim的血药浓度，结果满意。
尼美舒利(nimesulide，Nim)的测定方法，国内尚未见报道，国外曾采用HPLC方法［1～3］，但操作繁琐。为研究该药在中国人体内的生物利用度和药动学过程，我们建立了专一性好、灵敏度高和操作简便的HPLC内标方法，用于测定人血浆中Nim的浓度。
1 实验材料及方法
1.1 药品及试剂
Nim对照品(Sigma公司)，用甲醇制成贮备液(Ⅰ)50.7 μg*ml-1和贮备液(Ⅱ)2.052 mg*ml-1，置4 ℃冰箱保存。Nim进口对照药及国产药(牡丹江制药厂)。内标物为甲苯磺丁脲(D-860，常州制药厂，批号960204)，用甲醇制成贮备液207.0 μg*ml-1，置4 ℃冰箱保存。水用去离子水。甲醇为优级纯。盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯。甲苯为分析纯，二次蒸馏。
1.2 仪器
岛津LC-6A高效液相色谱仪、SPD-6A紫外检测器、SCL-6A系统控制器、SIL-6A自动进样器、C-R4A数据处理机；岛津L-200SM电子分析天平(精确到0.01 mg)；TDx高速离心机(美国)；LDR4-8.4C离心机(北京医用离心机厂)；YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。
1.3 色谱条件
色谱柱YWG-C18(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相甲醇-磷酸二氢钾(0.05 mol*L-1，pH 5.02)(55∶45)；检测波长230 nm；柱温20 ℃；流速1.0 ml*min-1；柱压10198.9 kPa～10395.0 kPa(104 kgf*cm-2～106 kgf*cm-2)；灵敏度0.005 AUFS。
1.4 生物样品的处理
取血浆0.5 ml，加内标贮备液5 μl，摇匀，加甲醇0.5 ml，1 mol*L-1的盐酸0.3 ml，摇匀后加甲苯2 ml，震荡提取10 min后离心(3 000 r*min-1，4 ℃)10 min，尽量多吸取出甲苯层，氮气流吹干，加150 μl流动相溶解残渣，离心5 min(10 000 r*min-1)。取上清液20 μl进样。
2 结 果
2.1 Nim的色谱行为
图1中Nim与其代谢产物、内标物均有很好的分离度，内源性杂质对测定不产生干扰，基线平稳，保留时间合适。
图1 Nim色谱图
A-空白血浆色谱图；B-空白血浆外加尼美舒利1.026 μg和内标1.035 μg的色谱图；C-受试者服药后2 h的色谱图；①-甲苯磺丁脲(内标)；②-尼美舒利；③-尼美舒利代谢产物
2.2 Nim标准曲线的制备
2.2.1 溶液中Nim的标准曲线 取Nim贮备液(Ⅰ)，用流动相稀释成一系列的对照品溶液，浓度分别为0.2，1.0，2.5，5.0，7.5，10 μg*ml-1。于300 μl自动进样瓶中，精密加入5 μl的内标贮备液，氮气流挥干；再精密加入150 μl的上述一系列Nim对照品溶液，超声混匀，进样20 μl。以测得的Nim与内标的峰面积比值对尼美舒利的浓度进行回归，得回归方程(Ⅰ)：c=0.011 24+9.66 4A/Ais，r=0.997 9。线性范围0.2 μg*ml-1～10 μg*ml-1，最小检出浓度为0.2 μg*ml-1(S/N=3)。
2.2.2 血浆中Nim的标准曲线 于空白血浆0.5 ml中，分别精密加入Nim贮备液(Ⅱ)，使每份样品中Nim的实际浓度为0.256 5，0.497，1.026，2.565，5.130，6.560，8.330，10.78 μg*ml-1，按血样处理项下操作；以测得的Nim与内标的峰面积比值对Nim的浓度进行回归，得回归方程(Ⅱ)：c=0.148 6+1.820A/Ais，r=0.999 5。线性范围0.26 μg*ml-1～10.8 μg*ml-1，最小检出浓度为0.2 μg*ml-1(S/N=3)。
2.3 精密度试验
取含Nim为0.5，2.5，7.5 μg*ml-1浓度的血样，于同1 d内重复测定4次，其日内变异及重现性(μg*ml-1)分别为(0.478 5±0.004 8)，(2.107±0.018)，(6.777±0.023)，RSD分别为1.01%，0.84%，0.34%。于1周内重复测定4次，其日间变异及重现性(μg*ml-1)分别为(0.555 6±0.018 4)，(2.356±0.025)，(7.216±0.020)，RSD分别为3.31%，1.05%，0.280%。
2.4 回收率试验
2.4.1 萃取回收率 内标测定24次，平均萃取回收率为(60.4±2.8)%，RSD为4.64%。选取血浆中Nim的浓度为0.5，2.5，7.5 μg*ml-1，测定8次的萃取回收率分别为(72.2±5.97)%，(79.7±2.6)%和(88.4±3.7)%，RSD分别为8.27%，3.29%和4.15%，平均萃取回收率为(80.1±8.1)%，RSD为10.1%。
2.4.2 方法回收率 取已知含Nim为0.5，2.5和7.5 μg*ml-1浓度的血样，照样品测定方法测定含量4次，计算方法回收率分别为(89.9±1.3)%，(86.0±0.74)%和(92.2±0.3)%，RSD分别为1.47%，0.86%和0.32%；平均方法回收率为(89.4±3.1)%，RSD为3.5%。
2.5 血浆中Nim的稳定性
同一份Nim的血样标本，采样后即刻分离出血浆。一部分血浆立即按血样测定方法处理并测定；另一部分血浆置于-40 ℃冰柜保存2周后，37 ℃水浴融化，再按血样测定方法处理并测定。测定结果：峰面积未有减少，Nim在血浆中稳定。
2.6 临床测定
8名受试者，空腹po Nim 100 mg后，用上述方法处理血样，测定结果代入回归方程(Ⅱ)。数据经3P87药动学程序的拟合，药-时曲线如图2。
图2 正常人po 100 mg Nim进口药(1)或国产药(2)的血药浓度经时过程
3 讨 论
3.1 内标的选择
本实验中选取的内标物为甲苯磺丁脲(D-860)，其在甲醇、甲苯和流动相中稳定存在。在本实验条件下，内标峰形良好，且与Nim及其代谢物［1］有良好的分离度。
3.2 提取溶剂的选择 本实验用分析纯苯、甲苯提取，色谱图中有许多干扰峰，其中以甲苯的干扰峰略少些，故将甲苯二次蒸馏，删除干扰峰。此外曾用乙腈直接沉淀蛋白后进样，结果，溶剂用量大，故选择本实验的处理条件，以获得较高的灵敏度。
3.3 提取方法的评价
本实验采用溶剂萃取法，不仅使样品中的被测药物由0.5 ml浓集到150 μl，浓集倍数为(10/3)倍，而且还因为在萃取过程中，选择了合适的有机溶剂及一定的水相pH，可选择性地除去样品中的干扰杂质，达到提高被测药物的检测灵敏度的目的，Nim的萃取回收率均高于70%。应用本法测定血药浓度的经-时变化得到合理的药时曲线，与文献报道一致［4］。
尼美舒利(nimesulide，Nim)的测定方法，国内尚未见报道，国外曾采用HPLC方法［1～3］，但操作繁琐。为研究该药在中国人体内的生物利用度和药动学过程，我们建立了专一性好、灵敏度高和操作简便的HPLC内标方法，用于测定人血浆中Nim的浓度。
1 实验材料及方法
1.1 药品及试剂
Nim对照品(Sigma公司)，用甲醇制成贮备液(Ⅰ)50.7 μg*ml-1和贮备液(Ⅱ)2.052 mg*ml-1，置4 ℃冰箱保存。Nim进口对照药及国产药(牡丹江制药厂)。内标物为甲苯磺丁脲(D-860，常州制药厂，批号960204)，用甲醇制成贮备液207.0 μg*ml-1，置4 ℃冰箱保存。水用去离子水。甲醇为优级纯。盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯。甲苯为分析纯，二次蒸馏。
1.2 仪器
岛津LC-6A高效液相色谱仪、SPD-6A紫外检测器、SCL-6A系统控制器、SIL-6A自动进样器、C-R4A数据处理机；岛津L-200SM电子分析天平(精确到0.01 mg)；TDx高速离心机(美国)；LDR4-8.4C离心机(北京医用离心机厂)；YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。
1.3 色谱条件
色谱柱YWG-C18(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相甲醇-磷酸二氢钾(0.05 mol*L-1，pH 5.02)(55∶45)；检测波长230 nm；柱温20 ℃；流速1.0 ml*min-1；柱压10198.9 kPa～10395.0 kPa(104 kgf*cm-2～106 kgf*cm-2)；灵敏度0.005 AUFS。
1.4 生物样品的处理
取血浆0.5 ml，加内标贮备液5 μl，摇匀，加甲醇0.5 ml，1 mol*L-1的盐酸0.3 ml，摇匀后加甲苯2 ml，震荡提取10 min后离心(3 000 r*min-1，4 ℃)10 min，尽量多吸取出甲苯层，氮气流吹干，加150 μl流动相溶解残渣，离心5 min(10 000 r*min-1)。取上清液20 μl进样。
2 结 果
2.1 Nim的色谱行为
图1中Nim与其代谢产物、内标物均有很好的分离度，内源性杂质对测定不产生干扰，基线平稳，保留时间合适。
图1 Nim色谱图
A-空白血浆色谱图；B-空白血浆外加尼美舒利1.026 μg和内标1.035 μg的色谱图；C-受试者服药后2 h的色谱图；①-甲苯磺丁脲(内标)；②-尼美舒利；③-尼美舒利代谢产物
2.2 Nim标准曲线的制备
2.2.1 溶液中Nim的标准曲线 取Nim贮备液(Ⅰ)，用流动相稀释成一系列的对照品溶液，浓度分别为0.2，1.0，2.5，5.0，7.5，10 μg*ml-1。于300 μl自动进样瓶中，精密加入5 μl的内标贮备液，氮气流挥干；再精密加入150 μl的上述一系列Nim对照品溶液，超声混匀，进样20 μl。以测得的Nim与内标的峰面积比值对尼美舒利的浓度进行回归，得回归方程(Ⅰ)：c=0.011 24+9.66 4A/Ais，r=0.997 9。线性范围0.2 μg*ml-1～10 μg*ml-1，最小检出浓度为0.2 μg*ml-1(S/N=3)。
2.2.2 血浆中Nim的标准曲线 于空白血浆0.5 ml中，分别精密加入Nim贮备液(Ⅱ)，使每份样品中Nim的实际浓度为0.256 5，0.497，1.026，2.565，5.130，6.560，8.330，10.78 μg*ml-1，按血样处理项下操作；以测得的Nim与内标的峰面积比值对Nim的浓度进行回归，得回归方程(Ⅱ)：c=0.148 6+1.820A/Ais，r=0.999 5。线性范围0.26 μg*ml-1～10.8 μg*ml-1，最小检出浓度为0.2 μg*ml-1(S/N=3)。
2.3 精密度试验
取含Nim为0.5，2.5，7.5 μg*ml-1浓度的血样，于同1 d内重复测定4次，其日内变异及重现性(μg*ml-1)分别为(0.478 5±0.004 8)，(2.107±0.018)，(6.777±0.023)，RSD分别为1.01%，0.84%，0.34%。于1周内重复测定4次，其日间变异及重现性(μg*ml-1)分别为(0.555 6±0.018 4)，(2.356±0.025)，(7.216±0.020)，RSD分别为3.31%，1.05%，0.280%。
2.4 回收率试验
2.4.1 萃取回收率 内标测定24次，平均萃取回收率为(60.4±2.8)%，RSD为4.64%。选取血浆中Nim的浓度为0.5，2.5，7.5 μg*ml-1，测定8次的萃取回收率分别为(72.2±5.97)%，(79.7±2.6)%和(88.4±3.7)%，RSD分别为8.27%，3.29%和4.15%，平均萃取回收率为(80.1±8.1)%，RSD为10.1%。
2.4.2 方法回收率 取已知含Nim为0.5，2.5和7.5 μg*ml-1浓度的血样，照样品测定方法测定含量4次，计算方法回收率分别为(89.9±1.3)%，(86.0±0.74)%和(92.2±0.3)%，RSD分别为1.47%，0.86%和0.32%；平均方法回收率为(89.4±3.1)%，RSD为3.5%。
2.5 血浆中Nim的稳定性
同一份Nim的血样标本，采样后即刻分离出血浆。一部分血浆立即按血样测定方法处理并测定；另一部分血浆置于-40 ℃冰柜保存2周后，37 ℃水浴融化，再按血样测定方法处理并测定。测定结果：峰面积未有减少，Nim在血浆中稳定。
2.6 临床测定
8名受试者，空腹po Nim 100 mg后，用上述方法处理血样，测定结果代入回归方程(Ⅱ)。数据经3P87药动学程序的拟合，药-时曲线如图2。
图2 正常人po 100 mg Nim进口药(1)或国产药(2)的血药浓度经时过程
3 讨 论
3.1 内标的选择
本实验中选取的内标物为甲苯磺丁脲(D-860)，其在甲醇、甲苯和流动相中稳定存在。在本实验条件下，内标峰形良好，且与Nim及其代谢物［1］有良好的分离度。
3.2 提取溶剂的选择 本实验用分析纯苯、甲苯提取，色谱图中有许多干扰峰，其中以甲苯的干扰峰略少些，故将甲苯二次蒸馏，删除干扰峰。此外曾用乙腈直接沉淀蛋白后进样，结果，溶剂用量大，故选择本实验的处理条件，以获得较高的灵敏度。
3.3 提取方法的评价
本实验采用溶剂萃取法，不仅使样品中的被测药物由0.5 ml浓集到150 μl，浓集倍数为(10/3)倍，而且还因为在萃取过程中，选择了合适的有机溶剂及一定的水相pH，可选择性地除去样品中的干扰杂质，达到提高被测药物的检测灵敏度的目的，Nim的萃取回收率均高于70%。应用本法测定血药浓度的经-时变化得到合理的药时曲线，与文献报道一致［4］。
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