RP-HPLC法测定苁蓉通便口服液中大黄素的含量

苁蓉通便口服液是由肉苁蓉、何首乌、枳实、蜂蜜组方经提取制成的中药制剂，具有滋阴补肾、润肠通便的功效，临床上常用于中、老年人，病后、产后等虚性便秘及习惯性便秘。收载于《卫生部药品标准》新药转正标准第12册中。原标准中采用紫外分光光度法测定含量。该方法需要经过多次回流提取，操作烦琐、费时，且重现性和准确性差。本文采用高效液相色谱法测定苁蓉通便口服液何首乌中大黄素的含量，结果准确、操作方便，可用于该制剂的质量控制。经方法学研究，证明方法可行。现报道如下。
1 仪器与试药
日本岛津LC-2O1O AHT高效液相色谱仪；自动进样系统；CLASS-VP ver．6．1色谱数据工作站；BOLONGM-SC-3O2超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)；日本岛津MV-245O型紫外分光光度计。
甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；水为重蒸水；大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0753-9910，经
HPLC面积归一化法测定纯度为99.27%)；苁蓉通便口服液(市售甘肃天水制药厂生产，批号030401、031105、
040205，规格：10mL/瓶)。
2 色谱条件
色谱柱：Hypersil-BDS C18(200 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85：15，v／v)；检测
波长为254nm．；流速：1.0 mL/min；柱温：常温；进样量：10μL；面积外标法定量。
3 方法与结果
3．1 供试品溶液的制备
3．1．1 样品溶液的制备精密吸取苁蓉通便口服液1OmL，置分液漏斗内，加入乙醚振摇提取3次，每次30mL，合并乙醚提取液，置蒸发皿内蒸干，加甲醇溶解，然后转移至25mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过。
3．1．2 阴性空白对照溶液的制备按其质量标准中的处方比例，制备缺味(何首乌)中药的阴性空白样品对照液，照上述“样品溶液的制备”项下方法制成阴性空白对照溶液。
3．1．3 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品20.0mg，置5O mL量瓶中，加入甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5mL置1OmL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每毫升含大黄素0.2 mg的对照品溶液。
3．2 系统适用性试验
取大黄素对照品溶液、阴性空白对照溶液和样品溶液，按上述色谱条件项下进样1OμL，得HPLC图谱。
可知，阴性空白对照溶液在大黄素对照品出峰处域没有干扰峰出现，故样品中的其他组分对大黄素测定无干扰作用。理论塔板数按大黄素峰计算不应低于3000。分离度>1.5，大黄素对称因子为0.95～1.O5。
3．3 线性关系的考察
精密称取大黄素对照品约17.29 mg，置5O mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为大黄素对照品储备液。精密吸取储备液0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL分别置1O mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，分别进样1OμL，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、大黄素浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=2.962×1000000X-4.958×1000，r=0.9999。
结果表明大黄素溶液在6.92～3l1μg/mL 呈良好的线性关系。
3．4 精密度试验
取同一批供试品溶液，进样1OμL，重复进样5次，测得大黄素峰面积的RSD为0.10%。再取大黄素对照品溶液，重复进样5次，结果大黄素峰面积的RSD为0.07 。
3．5 重现性试验
取同一批号样品5份(批号：040205)，按“3．1．1”项下方法制备供试液，平行测定，结果大黄素的含量为5.56mg/支，RSD为1.49%(n=5)。说明本方法重现性良好。
3．6 稳定性试验
取同一批号样品溶液(批号：030401 01，每毫升含大黄素0.383mg)，在常温下放置12h，每隔2h测定1次，
连续共测定6次，结果大黄素峰面积RSD为0.56%。表明样品溶液在12h内稳定性良好。
3．7 回收率试验
采用加样回收试验方法，精密吸取已知大黄素含量的样品5.0 mL 9份，分别精密加入大黄素对照品储备液4.0、5.0、6.0 mL各3份，相当于样品标示含量的8O%～120%的大黄素，置分液漏斗内，加入乙醚振摇提取3次，每次3OmL，合并乙醚提取液，置蒸发皿内蒸干，加甲醇溶解移入25mL量瓶中。再用甲醇溶液稀释定容至刻度，混匀。
分别进样测定，大黄素RSD为1.23％。
3．8 样品含量测定
精密量取样品1OmL，按“3．1．1”项下方法制备供试样品溶液。另精密称取大黄素对照品适量，同“3．1．3”项下制备对照品溶液，按上述色谱条件进样1OμL，记录大黄素峰面积，按外标法计算含量。
为有效控制苁蓉通便口服液的质量，根据生产的实际情况和样品含量测定的结果，暂定每毫升苁蓉通便口服液中含大黄素不得少于3.2 mg。
4 讨论
4．1 检测波长的选择
取上述大黄素对照品溶液，在紫外分光光度计上于波长200～400nm处扫描，结果在254nm波长处有最大吸收。故以254nm为检测波长。
4．2 提取方法的选择
本实验通过分别采用以下方法进行比较：① 乙醚萃取法；②通过D108型大孔树脂柱吸附法；③ 甲醇沉淀杂质法，对同一批号的苁蓉通便口服液进行提取、分离，并按含量测定方法测定供试品溶液中大黄素的含量。结果3种方法测定结果相差不大，而以乙醚提取法峰形较好，杂质干扰少，且基线平稳。虽然将样品采用通过D108型大孔树脂柱吸附法测定大黄素的含量结果与乙醚提取法相似，但该方法样品提取操作方法烦琐、费时。用甲醇沉淀杂质法，虽然方法简单，但杂质沉淀不完全，图谱中杂质峰响应值过大。故采用乙醚萃取法，操作方便，结果准确可靠。
4．3 何首乌在方中为主药，含羟基蒽醌衍生物，主要为大黄酚、大黄素、大黄酸等，但是我们在苁蓉通便口服液样品的分析中发现方中何首乌蒽醌类成分是以游离型大黄素存在的，没有检出大黄酚和大黄酸。因此，选择何首乌中的大黄素为含量测定指标，建立质量控制标准，结果满意，方法的重现性好。