HPLC法测定西洋参蜂王浆口服液中的人参皂甙与癸烯酸

摘要　目的：测定西洋参蜂王浆口服液中的人参皂甙和癸烯酸。方法：高效液相色谱法，C₁₈柱，流动相乙腈-水，检测波长203nm，Sep-pak小柱处理样品，外标法定量。结果：线性范围10～100μg^．ml^-1，检测限6.8～50ng，回收率97.8%～99.6%。结论：该法同时测定人参皂甙和癸烯酸，简便、省时。
　　关键词　高效液相色谱法　西洋参蜂王浆口服液　人参皂甙　癸烯酸

　　“瑞草牌”西洋参蜂王浆口服液是由西洋参、五味子、鲜王浆和蜂蜜制成。人参皂甙是西洋参的主要成分，10-羟基-2-癸烯酸(以下简称癸烯酸)是蜂王浆的有效成分。通过测定口服液中的人参皂甙和癸烯酸，可以评价该制剂的质量。内控法是用不同方法分别提取样品后，用比色法测定总皂甙，用薄层扫描法测定癸烯酸的含量，方法费时且需大量溶剂。用HPLC法测定皂甙的方法文献^［1～6］已有报道，但没有报道同时测定人参皂甙和癸烯酸方法。本文建立了用Sep-pak小柱处理样品后，用HPLC同时测定人参皂甙和癸烯酸方法。此法简便、准确、省时。

1.1　仪器与试剂
　　Varian HPLC 9012泵，9050UV检测器，LC star工作站。
　　乙腈为HPLC试剂。其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。
　　人参皂甙(Re,Rg₁,Rb₁)、癸烯酸对照品(中国药品生物制品检定所)。西洋参蜂王浆口服液样品(中国医学科学院药用植物研究所实验药厂)。
1.2　色谱条件
　　色谱柱YWGC₁₈不锈钢柱(250mm×4.6 mm,5μm),Waters C₁₈保护柱；Varian色谱工作站。流动相:测定Re,Rg₁和癸烯酸用乙腈-甲醇-水(30∶5∶70)；测定Rb₁用乙腈-水(40∶60)。流速1ml^．min^-1；检测波长203nm。在上述色谱条件下，Re+Rg₁与癸烯酸的保留时间分别为8～9min和11min左右；Rb₁的保留时间为5.5min左右，色谱图见图1,图2。

 

1.3　线性关系考察
　　精密称取人参皂甙Re，Rg₁和癸烯酸各约10mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容，为混标贮备液，再将此溶液稀释，浓度范围10～100μg^．ml^-1。Rb₁标准系列通过稀释Rb₁标准品(1mg^．ml^－1)，浓度范围10～100μg^．ml^-1。将标准系列溶液各进样20μl，在10～100μg^．ml^-1，得回归方程：Re+Rg₁为Y=-14363+1793.1X,r=0.9995；癸烯酸为Y=1694+25883X,r=0.9999;Rb₁为Y=-1289.7+1801.4X,r=0.9999。
1.4　精密度与检测限
　　准确配制相当于样品液浓度的各对照品溶液，于一日内测定5次，得日内精密度(RSD%)：Re+Rg₁为2.9%，癸烯酸为1.3%，Rb₁为1.1%。最低检测限：Re+Rb₁为35ng(信噪比=3)，癸烯酸为6.8ng(信噪比=3)，Rb₁为50ng(信噪比=3)。
1.5　样品测定
1.5.1　样品的处理　利用Sep-pak柱对样品进行预处理。先用5ml甲醇，2ml水清洗Sep-pak柱，然后上样0.6ml，用水2ml、8%甲醇2ml洗去大部分糖类及色素类杂质，最后用甲醇2ml洗脱，用流动相定容至5ml。
1.5.2　样品检测结果　各批样品经预处理后，进样20μl,代入标准曲线中计算，结果见表1。

表1　样品中人参皂甙和癸烯酸的含量测定结果

Re+Rg1 mg．ml-1	RSD %	癸烯酸 mg．ml-1	RSD %	Rb1 mg．ml-1	RSD %
0.177	4.5	0.350	2.5	0.154	3.1
0.198	4.9	0.300	3.1	0.052	2.7
0.207	4.7	0.269	3.3	0.112	2.5

注：n=3

1.6　加样回收试验
　　精密量取已知含量的西洋参蜂王浆样品，准确加入一定的Re+Rg₁，癸烯酸，Rb₁对照品贮备液，按照1.5样品处理方法处理和按样品测定方法测定，同样处理3份。计算回收率。结果见表2。

表2　样品中Re+Rg₁，癸烯酸，Rb₁的回收率实验结果

待测成分	对照品量 　 mg	测得量 　mg	回收率 %	RSD %
Re+Rg1	0.264	0.263	99.6	4.9
癸烯酸	0.137	0.134	97.8	3.5
Rb1	0.0890	0.0874	98.2	3.6

注：n=3

2.1　文献［1］报道人参皂甙水解后生成皂甙元，根据甙元的不同，将人参皂甙分为3组：Rb组、Rg组和R₀组。Rb组和Rg组生理活性较强，R₀组较弱。本文根据所能得到的对照品测定了口服液中的Re+Rg₁和Rb₁的含量，因Re和Rg₁同属一组，不易完全分开，故选择一流动相，使二者以单峰出现。因样品中Re与Rg₁的峰面积相近，为更接近样品实际，用Re+Rg₁(1∶1)为对照品。
2.2　检测波长的选择：经紫外扫描人参皂甙，无最大吸收波长，仅存在末端吸收，癸烯酸的最大吸收波长为211nm，因癸烯酸的消光系数远大于皂甙，所以选择203nm作为检测波长。
2.3　内控法测定样品需要大量溶剂且费时，用比色法测定总皂甙需时3d，用薄层扫描法测定癸烯酸需2d。用本文建立的HPLC法测定法1d即可完成测定Re+Rg₁,Rb₁和癸烯酸的含量，用Sep-pak小柱处理样品简单、节省溶剂。
2.4　西洋参样品除含有Re,Rg₁,Rb₁和癸烯酸外，在Re和Rg₁之前尚有未知峰，可能是其他皂甙，因我们只有Re,Rg₁，Rb₁对照品，所以用HPLC法未测定此峰，因此测定总皂甙的结果较比色法低。
2.5　在实验过程中，我们曾选用苯乙酮作为内标，从实验结果看，使用内标法和外标法的精密度相差不大。内标法的RSD(n=3)为3.7%(Re+Rg₁)和0.8%(癸烯酸)，外标法的RSD(n=3)为2.9%(Re+Rg₁)和1.3%(癸烯酸)。因进样量用20μl较准确，故测定时采用外标法定量。