高效液相色谱法测定大豆异黄酮的含量

1.1仪器

采用依利特高效液相色谱仪系统，包括：P230溶剂输送泵（两台）、UV230紫外检测器、柱温箱、DG230－2自动脱气机、EC2000工作站。

1.2试剂

乙腈、甲醇：色谱纯；水：自备超纯水；样品制备用溶剂为分析纯；异黄酮标准品Daidzin、Genistin、Daidzein、Genistein购自Sigma公司。

1.3样品预处理

1.3.1标准品溶液的配制

精确称取各标准品2.0－4.0mg，置于10ml的烧瓶中，分别加入色谱级甲醇，超声波助溶，移入10ml容量瓶中并定容至刻度，于40C温度下保存备用。

1.3.2样品溶液的制备

精确称取5mg左右的大豆异黄酮样品，置于10ml小烧杯中，加入80%的乙醇溶液，超声波助溶，移入10ml容量瓶中并定容至刻度，转入HPLC专用小瓶中封口，备测。

1.3.3色谱条件

色谱柱：Lichrosper 100RP-18(4.6mm×25mm；5μm)；流动相：含0.1%（V/V）冰醋酸的水溶液（A溶液），含0.1%（V/V）冰醋酸的乙腈溶液（B溶液）；时间程序：在35min内B溶液浓度从20%线性递增至40%；流量：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：400C；进样量：5μl；分析时间：35min/样品。

2.1仪器

高效液相色谱仪：岛津LC－6A型泵，紫外检测器SPD－6AV，自动进样器SIL－6A，数据处理装置C－R3A。

2.2试剂

甲醇：色谱纯；水：重蒸水；样品制备用酒精为分析纯；异黄酮标准品Daidzin、Genistin、Daidzein、Genistein购自Sigma公司。

2.3样品预处理

2.3.1标准品溶液的配制

精确称取各标准品2.0－4.0mg，置于10ml的烧瓶中，分别加入80%酒精，超声波助溶，移入10ml容量瓶中并定容至刻度，于40C温度下保存备用。

2.3.2样品溶液的制备

精确称取5mg左右的大豆异黄酮样品，置于10ml小烧杯中，加入80%的乙醇溶液，超声波助溶，移入10ml容量瓶中并定容至刻度，转入HPLC专用小瓶中封口，备测。

2.3.3色谱条件

色谱柱：日本岛津公司，Shim-Pack CLC ODS柱（150×6.0mm　ID；5μm）；流动相为甲醇：醋酸：水＝30：3.5：66.5；流速为0－8.5min时1.0ml/min，8.5－47min时1.5ml/min；柱温：500C；检测波长：254nm。

注：以上两种方法仅能测出大豆甙（DAIDZIN）、大豆甙元（DAIDZEIN）、染料木甙（GENISTIN）和染料木素（GENISTEIN）四种成份的含量。

3.1仪器

高效液相色谱仪：安捷伦HP1100，紫外检测器，四元泵，手动进样器。

3.2试剂

甲醇：色谱纯；水：重蒸水；样品制备用酒精为分析纯；异黄酮标准品大豆甙（Daidzin）、黄豆甙（Glycitin、染料木甙（Genistin）、大豆甙元（Daidzein）、黄豆甙元（Glycitein）、染料木素（Genistein）购自美国Sigma公司。

3.3样品预处理

3.3.1标准品溶液的配制

精确称取各标准品2.0－4.0mg，置于10ml的烧瓶中，分别加入80%酒精，超声波助溶，移入10ml容量瓶中并定容至刻度，于40C温度下保存备用。

3.3.2样品溶液的制备

精确称取3.0－4.0mg左右的大豆异黄酮样品，置于10ml小烧杯中，加入80%的乙醇溶液，超声波助溶，移入10ml容量瓶中并定容至刻度，转入HPLC专用小瓶中封口，备测。 3.3.3色谱条件

色谱柱：美国安捷伦公司，ZORBAX　Eclipe XDB-C18柱（150×6.0mm　ID；5μm）；流动相：色谱级甲醇（A），含5%（V/V）冰醋酸的水溶液（B），流动相梯度见附表；流速：1.0ml/min；柱温：200C；检测波长：254nm。

注：采用此法可以检测六种大豆异黄酮成份的含量，而且具有分离效果好、操作时间短的特点，但对仪器配置的要求较高。

附表：流动相梯度