1890型PCR荧光分析仪介绍及应用(1)

实时荧光定量PCR的应用

临床方面的应用
 疾病的临床早期诊断
 建立病原体病分子诊断标准
 疗效考评
 指导制订感染性疾病合理治疗方案
 了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况
 医院、血站及防疫站的确诊
 新药研究中药物的作用效果
 研究Elisa方法的漏检率
 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导 

遗传病诊断中的应用
 等位基因检测
 多基因遗传病的突变检测
 基因表达异常所致遗传病检测
 
在肿瘤诊断中的应用
 肿瘤相关基因表达的检测
 肿瘤标志物（肽类激素和酶）
 肿瘤耐药基因（MDR）
  
何谓PCR ?

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

试剂的定量原理：
Taqman水解探针定量
Roche杂交探针定量
分子信标定量
SYBR Green Ⅰ染料定量

Taqman探针、杂交探针、分子信标都是通过荧光能量共振转移
直接或间接的产生特定波长的荧光，使仪器能检测到

PCR的发展史

这项技术的发明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技术 公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮ Ａ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。 在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家 中也引起了强烈的反应。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后 把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短 短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛 的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技 术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖.

PCR原理和方法: (一)
众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺 嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制 时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶--ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最 后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。 假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
  　在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小 写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。 把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合 在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。

PCR原理和方法: (二)
第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让 ＤＮＡ模板变性变成单链。
第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT
ataagcccgaaaggttcgtt                  tatccaacggctaggcattt
ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。

影响PCR特异性的因素
退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。
减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。
引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。
改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。
模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。 

扩增反应可以无穷进行下去吗？
  答：不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进
 入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。
 所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原
 来以指数增加的速率变成平坦的曲线。
造成PCR进入平坡的原因有：
  引物和dNTP等消耗完毕
  Taq酶失活
  底物过剩
  非特异性扩增产物的竞争
  退火时产物的单链自己缔合
  变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用
　（焦磷酸化，双链DNA）。   
总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。

实时荧光定量PCR 的Ct值

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。