1890型PCR荧光分析仪介绍及应用(2)

2008-03-28点击：265

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Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。由于所设阈值都很低，所以Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没被放大，所以具有良好的重现性

由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。

仪器的Ct值定量原理

固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1890型PCR荧光分析仪的特点
-高速的加热降温循环系统
-采用长寿命的LED激发光源
-可对PCR扩增全过程进行实时动态监测
-无需开启PCR反应管，可避免在PCR期间及PCR之后产物污染，确保结果准确
-可用三种不同报告染料同时用于一个样品，在单一反应中取得更多信息
-全中文界面，灵活的程序设定、全面的分析和报告功能，全部参数可储存
-可打印多个或单个样本报告

仪器主要技术规格
样本数：                            32
反应管（光学玻璃管）长：          35mm
容积（反应体积）               10-20ul
温度范围：                   40℃-98℃
温度控制：                1℃/S-10℃/S
激发光波长：               470nm（LED）
发射光波长：           530，640，710nm
检测灵敏度：可在一个基因组中检测单拷贝
软件操作系统：                  Win2000
输入电源/功率：       AC220V 50HZ/800VA

仪器工作原理（一）

仪器工作原理（二）
图一盖中的加热器在计算机控制下向热室中交替注入热气和环境空气，热室中温度由风扇电机搅匀，由于空气无有效质量，热室可以迅速达到设置温度，由此进行PCR的温度循环。32个样品在周向马达的带动下逐一经过信号采集的光学系统，为采样的准确定位光学结构由丝杆马达进行微调。由长寿命的LED光源(470nm)激发毛细管中的荧光，该荧光通过一组复合滤镜和透镜分别同时到3个接收器上(520nm,640nm,710nm)完成了仪器的实时采样。

强大的软件功能
参数设置功能（包括温度、时间、循环数、升降温速率、检测通道选择）
样本资料记录功能
文件运行显示功能（PCR热循环数据显示、荧　　光检测数据显示）
检测数据分析功能
分析结果输出功能
故障保护和报警功能

先进的光路系统
选用长寿命LED激发,无需预热，无需校正
采用了先进的非球面镜设计，提升了仪器的光学性能，缩短了光程，使仪器更小巧
优质的滤光片，硬膜镀膜技术，窄带低背景高透过率不霉变
实时三色荧光检测，尽善尽美

传统96孔板和离心毛细管比较

毛细管	96孔板
标本量小，耗材成本稍高	标本量大，耗材成本低
由于离心，每个样品孔间温度均匀一性好(由于定量PCR必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转的样品架很好地解决了样品孔间的均一性，最大程度的保证了标准曲线与样品之间条件的一致性，避免了微小差别被指数级发大。)	由于加热模块的边缘效应，每个样品孔间温度存在差异
加热介质空气与反应体系无缝接触，接触面积大，故升降温速度快	96孔板反应面积大，故升降温速度慢
一个40个循环的实验只需30-45 分钟	一个40个循环的实验需要2小时
光源与检测器对每个样品来说是等距离的，减少了系统误差	每个样品孔距离光源和检测器光程不同，可能对结果产生影响