Development of Determination Nitrate/Nitrite in Water by Flow Injection/Sequential Injection Spectrometry

Zhao Ping

BeiJing Titan Instruments Co., Ltd ( Beijing, 100016)

Abstract: A review of the determination nitrate/nitrite in water by flow injection /sequential injection spectrometry including the flow line and parameters.

硝酸盐和亚硝酸盐氮一直是实验室常规检测项目之一，测定硝酸盐和亚硝酸盐氮的方法有很多，例如电化学法^[1]，化学发光法^[2]等等，尽管这些方法有很多优点，但有的方法需要昂贵复杂的仪器，有的则因为样品分析周期长而没有得到广泛的应用。光度法由于所需设备简单，灵敏度高，分析速度快而被广泛采用，流动注射分析（Flow injection analysis，简称FIA）法以其具有分析速度快，准确度和精密度高，设备和操作简单廉价、通用性强、效率高，消耗低，以及可以与多种检测手段相结合等一系列优点，因而已得到广泛的应用和推广^[3]，是化学分析自动化发展的一个重要方向。本文就对流动注射/顺序注射光度法分析硝酸盐和亚硝酸盐氮进行了综述。

Pratt等人研究了多通道流动注射同时分析生物样品中的硝酸盐和亚硝酸盐含量的方法（图1）。方法基于Greiss反应，样品溶液注入后被平分注入两个通道，通道一将硝酸盐还原为亚硝酸盐，从而获得总的亚硝酸盐含量，通道二只获得亚硝酸盐含量。在540nm处测得吸光度的值，此方法的检出限对于硝酸盐和亚硝酸盐均为25nM，流路管道为特氟龙管，带有低压流动连接装置，装置几乎不需维护，使用简便，得到的结果可于HPLC得出的结果相比较^[4]。

图1 多通道流动注射分析仪流路.

B，缓冲溶液；C，载流；Cd，镉柱；D1，D2，检测器1和2；MC，混合环；P， 泵；R，试剂；S，样品；SL₁和SL₂，样品环1和2；T，三通；V₁和V₂，阀1和 2； W，废液.

Petsul在微流控芯片上，用流动注射的方法测定了亚硝酸盐的含量（图2）。他所使用的芯片是在硼硅玻璃上用湿刻蚀技术刻了一个300微米宽，115微米长的通道，使用电渗流（EOF）控制。在0-100μM范围内获得良好的线性，相关系数0.999，5μM的硝酸根的RSD为2.6％（n=6），检出限0.20μM^[5]。后来，Petsul的研究小组还用同样的方法测定了硝酸盐的含量（图16），在线的微型覆盖铜的镉还原器则是由10％的甲酰胺和21％的二氧化硅组成的多孔硅玻璃制成的，还原器位于样品引入槽内，硝酸盐的标准溶液放置在进样槽内，并施加一个相对于废液槽50V的电压以驱动硝酸盐离子通过还原器。没有覆盖铜的镉硅玻璃也用于连接微流控芯片上的通道，以驱动电渗流和减少液体的流动，离开还原器的亚硝酸盐离子使用Griess重氮偶合反应检测，反应通过微型分光光度计检测，在0.5-20μM范围内获得良好的线性，相关系数0.985，5μM的硝酸根的RSD为8.3％（n=6），检出限0.51μM（μgml^-1）。虽然这种方法的检出限和线性相对标准偏差都不是十分令人满意，但毕竟使用微流控技术极大地减少了样品与试剂的消耗，同时使用电渗流即时也不需要任何机械装置^[6]。

图2 使用二极管阵列显微分光光度计测定亚硝酸盐的流路图。

微反应芯片装入一个绝缘盒中，微通道尺寸302mm宽，115mm深，粗线代表纤维光路，HVPS 1和2，高压电源；储液槽A，混合试剂；B，亚硝酸盐样品；C，废液1；D，废液2。

图3 还原硝酸盐的芯片流路。

流路刻蚀在基体上26.2mm×18.2mm×3.1 mm， 顶盖27mm×17.2mm×17.2 mm. 主要通道的长度：A–D是11.2mm，B–C是4.4 mm.

美国EPA 353.2，ESS220.3方法中介绍了流动注射分光光度法测定硝酸盐和亚硝酸盐含量的方法（图4），但其中插入气泡，属于气泡间隔连续流动分析，方法基于亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺重氮化，再与盐酸N-(1-萘基)乙二胺偶合，形成玫瑰红色的偶氮染料，用分光光度法测定，该方法适用于地表水，盐水及家庭工业废水，线性范围为0.05-10mg/L^[7,8]。

图4 EPA 353.2，ESS220.3方法流路图

EPA公布的Lachat 方法中使用了流动注射分析的方法（图5），此方法适用于测量湖水和雨水中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，方法的线性范围为0.03-2.00 mg N(as NO₃^－ + NO₂^－)/L，方法的检出限0.03 mg N/L。方法的原理与EPA 353.2 方法一致，但检测波长在520nm^[9]。

图5 Lachat 方法流路图

载流

采样环60cm

流通池

泵

排废

显色剂

缓冲溶液

镉还原柱

样品

 

张志军等人应用连续流动分析仪对环境水样中的硝酸盐氮进行了分析（图6），在碱性的硫酸肼条件下，将环境水样中的硝酸根用铜作催化剂还原成亚硝酸根，然后与磺胺生成重氮盐，再与N-(1-萘基)-乙二胺偶联生成粉红色的化合物，在550 nm处测定吸光值。简述了试剂浓度的确定原则和编写运行程序的方法。通过对标准样品的多次测定，测定值均在其保证值范围内，相对标准差为0.17% ，准确度高，精密度好。方法检测限可达0.003 mg/ L，环境水样加标回收率在94 %～102 %之间，样品分析速率可达50个/ h^[10]。

图6　硝酸盐氮的测定流程

王镇浦等人建立了水中痕量亚硝酸盐氮的N-(1-萘基)乙二胺-反相流动注射-分光光度法（图7），将N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐溶液注入到水样和对氨基苯磺酰胺溶液的混合流，在540nm处对反应形成的红色染料进行分光光度检测，线性范围在0.004-0.18mg/L检出限为0.0012mg/L，测定频率为50样/h，方法的灵敏度高，分析速度快，应用此方法测定南京玄武湖湖水的痕量亚硝酸盐氮，测定结果和相对标准偏差为3.5％，与国标法的测定结果相比较的平均相对误差为-4.2％，表明此法测定结果具有满意的精密度和准确度^[11,12]。

图7  NED－rFIA分光光度法流路

A， 蠕动泵； B， 反应管； C， 进样阀； D， 分光光度计； R1， 1.00g/LNED二盐酸盐溶液；R2， 20.0g/LSA溶液； S，亚硝酸盐氮试样；VR1， R1注入体积； L1和L2，反应管。

黎瑞敏等人也用流动注射的方法研究了硝酸盐和亚硝酸盐的同时测定（图8），用铜处理的镉作为填充还原剂，采取频率为40样/h，亚硝酸盐检出限为0.05 mg/L，硝酸盐检出限为0.09 mg/L，相对标准偏差为3.7％，4.2％^[13]。

图 8 流动注射光度法同时测定硝酸盐和亚硝酸盐的流路图

P，蠕动泵；V，多功能进样阀；D，检测器；R，记录仪，L1，L2，采样环；MC1，混合管；S，样品；RC，还原柱；Cs，载液；R1R2，试剂；W1W2，废液

Legnerova等人用顺序注射的方法自动同时检测了地表水中亚硝酸盐和硝酸盐的含量（图9）。亚硝酸盐含量的测定是基于Griess重氮偶合反应，形成红色染料，在540nm处被检测，硝酸盐通过一个微型的镉还原柱，将硝酸盐还原为亚硝酸盐后吸入混合环，与显色剂反应进入流通池，硝酸盐和亚硝酸盐的线性范围分别为0.5-50mg/L和0.05-1.0mg/L，相关系数分别为0. 9988和0.9993，检出限分别为0.10mg/L和0.015mg/L，相对标准偏差RSD分别为1.32％和1.10％（n＝3），样品分析频率为14样/h，方法适用与地表水中亚硝酸盐和硝酸盐的含量的测量，并与基于Griess重氮偶合反应流动注射方法和基于检测isotachophoretic的流动注射方法获得的结果进行了比较^[14]。

图9顺序注射光度法同时测定硝酸盐和亚硝酸盐的流路图

Oms等人也用顺序注射的方法对硝酸盐和亚硝酸盐的含量进行了分析（图10）。样品和试剂的引入与混合是通过推向反应环或检测器时的液流的反向流动达到的。亚硝酸盐的检测基于Griess－llosvay反应。硝酸盐起初被肼在碱性介质中还原成亚硝酸盐后分析，文中研究了先后顺序和峰的交叠区域这两个关键的参数，同时还研究了试剂的浓度，温度和干扰离子对反应的影响。在最优的条件下，可分析最低400μM的亚硝酸盐和硝酸盐，检出限分别为0.07和0.2ppm，此方法已经用于标准样品和大气过滤物和废水的测量^[15]。

图10 顺序注射分析硝酸盐亚硝酸盐流路

RC₁ 150cm×0.8mm i.d；RC₂ 150cm×0.5mm i.d，注射器体积5ml，最小进样体积 5μl，流速 2ml min^-1

Galhardo等人也用顺序注射的方法研究了在线监测天然水和废水中硝酸盐和亚硝酸盐含量的方法（图11），方法基于Griess-llosvay反应，硝酸盐通过铜镉还原柱还原为亚硝酸盐后进行分析，在线的切线过滤装置保证了本方法可以应用于含有颗粒物和沉积物的悬浮液的分析，方法的工作曲线可稳定4-5天，检出限分别为0.01mg l^-1和0.02g l^-1[16]。

图11 顺序注射检测亚硝酸盐硝酸盐的流路图（包括进样和过滤系统）

C，载流；SV，注射器阀；SP，注射泵；HC，线圈；RV，旋转选择阀；Reduc，还原柱；SL，采样管线；TF，切线过滤器；P，蠕动泵；S，试样；R1，显色剂；RS，还原柱再生液；D，光度计；AW：附属废液；W，废液，RC，反应环。

Pinto等人用顺序注射的方法研究了人类血清中硝酸盐和亚硝酸盐的含量（图12）。使用顺序注射的方法，可以准确地控制流体时间，使用的样品体积较小，精确控制反应条件，节约使用生物试剂和酶。对于亚硝酸盐的测定，使用150μl样品和50μl的Griess试剂。硝酸盐的测定是将其用0.09U的硝酸盐还原酶和75μlNADPH。硝酸盐和亚硝酸盐的测定线性范围上限可分别达到4mg/l 和3 mg/l，相对标准偏差RSD<5％，检出限分别为0.14 mg/l和0.03 mg/l。实验结果与手动的方法进行了对比，顺序注射的方法更快捷（比手动的方法快4倍），需要仅仅1/3的样品和1/2的硝酸盐还原酶^[17]。

图12 顺序注射检测血清中硝酸盐亚硝酸盐含量流路图

PP，蠕动泵；C，载流 (去离子水)； SV，螺线管阀； S，搅拌器； MC，混合室； HC，线圈(4 m；0.8 mm i.d.；直的)； MV，多位选择阀； RC，反应环(2.5 m； 0.8 mm i.d.；编结)； D，光度计； W，废液。

Haghighi等人根据分析气相的吸收检测了水溶液中的亚硝酸盐的浓度（图13），200 μl的亚硝酸盐溶液引入蒸馏水载流中，载流中的亚硝酸盐与盐酸流（2M）反应，液流被氧气分隔开，产生的气体产物被吹到氧气段中，与氧气反应后进入气液分离器，在这个自制的气液分离器中，气相和液相被分离开，然后进入自制的流通池中，使用紫外－可见分光光度计，在205nm检测气相的吸收。选择不同的条件下，可以得到两个线性范围，0-1000μg ml^-1，1000-2000μg ml^-1， 检出限7.5μg ml^-1，对于100μg ml^-1和500μg ml^-1样品的相对标准偏差分别为3.7％和1.0％，样品分析频率30样/h，干扰很少且容易克服，此方法成功地应用在spiked water，肉类和尿样中亚硝酸盐含量的分析^[18]。

图13 流动注射检测亚硝酸盐含量流路图

CS，载流(H₂O)；AS，酸溶液 (HCl，2M)；P，泵 (CS 流速: 0.38 ml min⁻¹，AS 流速: 0.23ml min⁻¹)；I，注入阀(200 μl)；O₂，载气(12.3 ml min⁻¹)；C1，反应环 (0.5 mm i.d.×35 cm)；C2，混合环(0.5 mm i.d.×35 cm)；T1和T2，三通；D，带自制流通池的光度计(205 nm)；GLS，气液分离器；W，废液。

图14 流动注射检测亚硝酸盐含量流路图

P1、P2，蠕动泵； V ，进样阀； L ，反应管； T ，反应池； D，流通池； P r，打印机； CR，微机控制和数据处理系统； R，混合试剂； C，载液(二次水) ； S，标准溶液或样品溶液。

马泓冰等人采用流动注射分析技术，以分光光度计为检测器，建立了同时测定血清中硝酸盐和亚硝酸盐的方法（图15），以α-萘胺-7-磺酸为显色剂，在520nm处比色，测定流路中装有锌-镉还原柱，将硝酸盐在线还原为亚硝酸盐，分析速度达45样/h，硝酸盐和亚硝酸盐的检出限分别为0.01mg/L，0.003mg/L，相对标准偏差分别为1.0％和0.5％^[20]。

图15 流动注射检测血清中硝酸盐和亚硝酸盐含量流路图

P，蠕动泵；V，采样阀；S，样品；C，载流（30g/L氯化铵和5g/L酒石酸钾钠等体积混合）；R，显色剂；A，两通阀；RC KR，反应管； W，废液；D，分光光度计。

Raigon以KCl作为浸提液，用流动注射光度分析法对土壤中以硝酸氮的测定进行了研究（图16），用一个镉还原柱还原硝酸根为亚硝酸根后，用常规流动注射分析系统测定硝态氮。本方法获得的硝态氮的结果与参考方法的结果比较具有很好的相关关系，样品分析频率为40样/h，15次重复测定结果的精密度高于0.55％^[21]。

图16 流动注射光度分析法对土壤中以硝酸氮的测定流路图

P，蠕动泵；V，注射阀；D，检测器；W，废液；R₁和R₂，反应管；RC，还原管；S－amide，对氨基苯磺酰胺；NED，N－乙酸乙二胺盐酸盐。

流动注射/顺序注射分光光度法测定硝酸盐/亚硝酸盐氮操作简单、方便易行,自动化程度高，必将广泛地应用在环境，食品，卫生等领域的自动分析中。

 

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高楼军将流动注射分析技术引入N-(1-萘基) 乙二胺光度法测定亚硝酸根的分析体系，建立了水样中微量亚硝酸根在线检测方法（图14）。亚硝酸根含量在0-500ug/L范围内具有良好的线性关系，检出限为1.0μg/L 亚硝酸根氮，此法操作简单，灵敏度高，适用于环境水样中亚硝酸根的实时性检测^[19]。