GPC及SPE净化-高效液相色谱法测定水产品中多种生物胺的研究
1 引言
生物胺广泛存在于富含蛋白质而又易于变质以及采取发酵工艺生产的食物及饮料中—即存在于水产品（主要是青皮红肉的鱼类）、肉制品、乳制品、蔬菜制品和各种酒类中[1]。食品和饮料中的生物胺是由蛋白酶作用于蛋白质生成氨基酸后，相应的氨基酸经细菌（乳酸菌、小球菌、霉菌）脱羧而来的：组胺是由组氨酸、酪胺是由酪氨酸、色胺是由色氨酸、尸胺是由赖氨酸分别形成的；腐胺由鸟氨酸或精胺形成；精脒和精胺可以在精脒合成酶和精胺合成酶催化下，通过腐胺与氨丙基的生化反应形成[2]。饮食中过度摄入生物胺能造成一些有害影响。导致一些症状的发生，如：外部血管膨胀、高血压、心悸、头痛、腹泻、呕吐、荨麻疹等[3]。Eerola等人认为发酵香肠中生物胺含量安全性标准为每千克干物质产品中的组胺和酪胺含量均小于100mg[4]。Loret等人建议啤酒中酪胺+组胺+尸胺+2-苯乙胺总含量的安全范围不超过20mg/l[5]。当鱼类产品中组胺含量达到4mg/g时，即可引起中毒。人体摄入组胺达100mg以上时，即易发生中毒，同时这也与个人体质的过敏性有关[6]。在出口贸易中欧美国家对水产品中的组胺含量提出严格要求：美国FDA限量标准为50mg/kg[7] ；欧盟限量标准为100mg/kg[8]。
生物胺残留的测定方法主要为气相色谱法和高效液相色谱法。由于许多生物胺热稳定性差，使气相色谱法的应用受到了一定的限制。因此，近年来国内外对高效液相色谱法检测生物胺残留量的研究较为活跃。但多为柱后衍生—荧光检测器检测的高效液相色谱法[9～14]。
R.T. Krause[9～10]用柱后衍生—荧光检测器检测的高效液相色谱法，还报道了[11]用柱后衍生—高效液相色谱—电化学检测器方法检测粮谷中的生物胺残留量。M. Sher Ali[12，14]用柱后衍生—荧光检测器检测的高效液相色谱法检测肝脏中的生物胺。De Kou and Hiemstra[13]用柱后衍生—荧光检测器—高效液相色谱法检测水果和蔬菜中的生物胺，并采用了固相提取技术。蒋新明用柱后衍生—荧光检测器—高效液相色谱法检测了土壤中的生物胺，样品中未经过净化直接测定。于文莲用柱后衍生—荧光检测器—高效液相色谱法检测了粮谷中的生物胺，样品净化采用的是液-液萃取方法，操作过程十分繁琐。M.L.LZQUIERDO 采用OPA（邻苯二甲醛）柱后衍生荧光检测器检测，反相离子对色谱分离啤酒中生物胺，分离时间50分钟。Vale SR采用OPA（邻苯二甲醛）柱后衍生荧光检测器检测，反相离子对色谱分离奶酪中生物胺，分离时间80分钟[15-16]。此外，黄美英采用丹酰氯衍生-聚酰胺薄膜层析测定4种多胺；I.Rodriguez采用毛细管电泳法荧光检测器检测酱油中8种生物胺；Kovacs A则采用毛细管电泳法紫外检测器检测红酒与意大利腊肠中7种生物胺，并用ACCQ衍生，检测低限远不如HPLC。另外对液-液萃取和固相萃取进行比较，证明各项参数后者都要优于前者[17-19]。
综上所述：可以看出目前国内外对生物胺的各种检测方法中，普遍存在着前处理过程烦琐、净化效果不理想、检出限低等不足。
2 实验仪器与材料
2.1 主要仪器
2.1.1 HPLC仪：美国Waters公司，配1525二元泵、2475荧光检测器、717自动进样器、TCM柱温箱、在线脱气机；
2.1.2 凝胶过滤色谱仪： AccuPrepTM J2 Scientific；
2.1.3 超纯水净化系统：法国密理博公司，mini-Q synthesis型；
2.1.4 固相萃取装置，VISIPREP；
2.1.5 氮气吹干仪：美国N-EVAP 111型；
2.1.6 北京医用离心机厂LD5-2A型离心机；
2.1.7 上海医科大学仪器厂XW-80A涡流混合器；
2.1.8 pH仪：上海雷磁仪器厂；
2.1.9 数显恒温水浴锅：金坛富华HH-2型；
2.2 试剂
所有用水均为milli-Q synthesis制备的高纯水（≥18.2MΩ）
2.2.1 甲醇：色谱纯，Fisher公司；
2.2.2 乙腈：色谱纯，Fisher公司；
2.2.3 乙酸乙酯：色谱纯，Fisher公司；
2.2.4 丙酮：色谱纯，TEDIA公司；
2.2.5 甲苯：色谱纯，TEDIA公司；
2.2.6 盐酸：优级纯；
2.2.7 磷酸：优级纯；
2.2.8 碳酸氢钠：分析纯；
2.2.9 碳酸钠：分析纯；
2.2.10 氢氧化钠：分析纯；
2.2.11 磷酸氢二钠：分析纯；
2.2.12 生物胺标准品：酪胺(tyramine)、色胺(tryptamine)、精胺(spermine)、精脒(spermidine)、腐胺(putrescine)为ACROS公司产品（纯度在97%以上）；组胺(histamine)、尸胺(cadaverine)为Fluka公司产品（纯度在97%以上）；
2.2.13 丹酰氯（Dansyl chloride）：ALDRICH公司（纯度在99%以上）；
2.2.14 碳酸钠—碳酸氢钠缓冲溶液（pH11.5）：在正常室温下于0.2 mol/ml碳酸钠溶液中滴加0.2 mol/ml碳酸氢钠溶液直至pH=11.5（用pH仪测量）；
2.2.15 0.01 mol/ml氢氧化钠溶液，配制0.01 mol/ml氢氧化钠溶液，调pH=12；
2.2.16 衍生化试剂：称取0.450g丹酰氯溶于乙腈中并定容至50 ml，经过0.45μm滤膜过滤，于冰箱-20℃下保存备用。
2.2.17 生物胺标准储备液（单标，1 mg/ml）：称取0.100g标准物溶于0.1 mol/ml盐酸溶液中，于100 ml棕色容量瓶定容至刻度（其中酪胺和色胺先用3ml甲醇溶解后再用0.1 mol/ml盐酸溶液定容至100ml），放于冰箱中4℃保存，有效期一周。
2.2.18 混合标准储备溶液：从七个单标储备液（2.2.17）中，取色胺5 ml，酪胺8 ml，组胺25 ml，腐胺、尸胺、精脒、精胺各取1ml于100ml 棕色容量瓶中，0.1 mol/ml盐酸溶液定容至刻度。
此混合标准储备溶液中各种生物胺的浓度（g/ml）：腐胺、尸胺、精脒、精胺均为10g/ml，色胺50 g/ml，酪胺80 g/ml，组胺250 g/ml，。
2.2.19 系列混合标准工作液：将混合标准储备液分别稀释1000/1，1000/2，1000/3，1000/4，1000/5，1000/10 倍，得六个不同浓度的系列混合标准工作液，现用现配。
2.2.20 ODS-C18固相萃取净化柱：Agilent公司，500mg/3ml。
2.3 试验材料
试验用水产品样品为大连产黄鱼。
3 实验方法
3.1样品的预处理
称取5g（精确至0.01g）鲅鱼样品于50ml塑料离心管中，加入15ml三氯醋酸，在匀质机上充分混匀后离心，4000r/min离心3min,上清液通过滤纸过滤接于100ml鸡心瓶中，将剩下的残余样再加入15ml三氯醋酸重复上面的操作2次。合并3次的三氯醋酸，用2mol/L NaOH中和至中性后于60℃水浴条件下减压蒸馏至干，再用10ml 1:1的乙酸乙酯和环己烷溶液溶解。静置一段时间待有醋酸盐结晶沉淀，离心，过0.45μm滤膜，清液待上GPC。
3.2 GPC净化条件
流动相：乙酸乙酯-环己烷（1+1）；
流速：4ml/min；
紫外检测波长：254nm；
进样量：5ml（过滤膜后的清液）；
收集流份：接取9～19min的流份。
将收集的流份在40℃水浴条件下减压蒸馏至近干，用乙酸乙酯-环己烷（1+1）转移到15ml塑料离心管中，40℃水浴条件下氮气吹干，加入1ml 0.1mol/L的盐酸溶解，待衍生。
3.3 衍生化
在经过GPC净化后并用盐酸溶解的1ml样液中先后加入1ml衍生剂(2.2.16)和1ml pH 11.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1 min后置于60℃水浴锅中衍生15min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
3.4 衍生物的固相萃取
将衍生后的离心管于40℃水浴条件下用氮气将所含的有机溶剂吹干，之后加入0.5ml 0.01M氢氧化钠溶液（pH=12）。将ODS-C18固相萃取净化柱与VISIPREP固相萃取装置相联，先用6ml甲醇洗柱后用6ml水洗柱 ；将pH值调到12的样液上柱，流速控制在0.5d/s；然用6ml 20%浓度的丙酮-水溶液淋洗萃取柱，流速控制在1 d/s；最后用3ml乙腈将生物胺衍生物洗脱，流速控制在0.5d/s。收集乙腈洗脱液于15 ml离心管中，40℃水浴条件下氮气吹干。用微量取液枪吸取1.0 ml乙腈溶解残留物。
3.5 色谱条件：
上述乙腈溶解残留物经0.45μm膜过滤,进样10μl进行HPLC分析。根据峰保留时间定性，根据峰面积外标法定量。
色谱柱：Inertsil ODS-3 C18柱，250×4.6 mm，粒度5μm
柱温：25℃；
流动相：乙腈－水；
流速：1.0 ml/min
进样量:10μl
荧光检测器波长：Ex=340nm，Em=515nm。
梯度洗脱程序：见表3-1
表3-1 梯度洗脱程序
4 结果与讨论
4.1 净化方法的选择
测定食品中的生物胺时提取剂的选择要满足两个条件：一是生物胺在该溶剂中有很好的溶解度；二是能够沉淀蛋白。在所有检测食品中生物胺的方法中不外乎两种提取剂：酸和有机溶剂。德国人Lange、Thomas 和 Wittmann对提取各种食品中生物胺的提取剂做了研究发现：三氯醋酸对鱼类、肉类、香肠、火腿、罐装泡菜提取时除蛋白效果好净化结果理想；盐酸对各种奶酪提取时除蛋白效果好净化结果理想[19]。本文比较了三氯醋酸、高氯酸、盐酸和甲醇在提取鲅鱼中生物胺时的效果，发现三氯醋酸净化效果较好。
本文研究选用GPC净化样品提取液，试验研究了GPC净化条件，将生物胺标准溶液、鱼样品、加标的鱼样品按样品提取方法进行提取，氮气吹干后，乙酸乙酯-环己烷（1+1）溶解，离心，过0.45μm滤膜，清液上GPC。在流动相流速4ml/min 条件下，大分子干扰物质在4～8分钟出峰，生物胺标准出峰时间为9～15分钟。因此，用GPC净化时应收集9～15 分钟流份。为保证回收率，确定为收集9～19 分钟流份。
4.2 柱前衍生条件的选择
生物胺即没有荧光发色基团也没有紫外发色基团，但是丹酰氯可以同伯胺或仲胺基上的活泼氢反应,脱掉一分子的HCl生成具有荧光和紫外光的衍生物，反应式如下：
R1R2-NH2 + Dansyl-Cl →R1R2NH-Dansyl + HCl
在这一反应过程中起决定性作用的条件有四个：衍生剂的浓度、pH值、衍生温度、衍生时间[20]。
4.2.1 衍生剂的浓度
在不改变其它反应条件只改变衍生剂的浓度的条件下，做了14组实验，每组做3次平行实验取3次测量的平均值，结果如图1：
从图1中可以看出衍生剂浓度在9mg/ml时，七种生物胺衍生效果最好，丹酰氯衍生物的量最多。大于9mg/ml浓度时生物胺衍生物的生成量无明显变化而且会造成试剂的浪费。
4.2.2buffer的pH值
生物胺和衍生剂要在碱性条件下才能发生反应，选择一个合适pH的buffer至关重要。本文选取了碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液体系，配制了不同pH的缓冲溶液进行实验研究，结果如图2：
由图2可以得出色胺、腐胺、尸胺在buffer的pH=9时有最大生成量，之后随着pH值的增加而略减少而当pH值增加到11.5时，生物胺的生成量与pH=9.5时基本相当；其它4种生物胺都是在pH=11.5时有最大生成量。因此，综合考虑生物胺衍生反应中buffer的pH为11.5。
4.2.3 衍生温度与时间
关于生物胺衍生的衍生温度与时间问题，以往的研究比较多，但结论不统一。 作者按照表1衍生温度和时间条件进行了实验，不同条件下七种生物胺的生成量同最稳定的室温隔夜条件下的七种生物胺生成量相比结果相似。但从省时节能方面来考虑，60℃水浴15min是比较合适的衍生条件，可以满足日常的一般检验。
表1：衍生温度与对应的时间
4.3 色谱分离条件的选择
本方法采用国产Spherisorb C8柱，通过选择流动相乙腈和水的配比，建立了表3-1的梯度洗脱条件，在此条件下，在20分钟内完成7种生物胺的分离，色谱分离效果很好。标准溶液、加标鱼样品和鱼样品色谱图分别见图3、图4和图5。
从图3可见，7种生物胺得到完全分离，色谱分离效果非常好，分离度符合要求。
比较图4和图5可见，在样品色谱图上无干扰峰存在。说明在本方法所确定的试验条件下，样品净化效果好，可满足检测要求。
图3. 7种生物胺标准色谱图
1. 色胺9.496;2. 腐胺11.620;3.尸胺12.426;4.组胺13.212;
5.酪胺16.271;6.精脒16.742;7.精胺19.199.
单位:min
图4. 鱼样品添加生物胺标准样品色谱图
注：图中 腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.04mg/kg；
色胺0.2 mg/kg；酪胺0.32mg/kg；组胺1.0 mg/kg
图5. 鱼样品色谱图
各种生物胺含量（mg/kg）：色胺0.015,腐胺0.00093,尸胺0.0044,组胺0.034,酪胺0.045,精脒0.0078,精胺0.0054。
4.4 线性关系试验
将混合标准储备液分别稀释1000/1，1000/2，1000/3，1000/4，1000/5，1000/10 倍，得六个不同浓度的系列混合标准工作液，按上述色谱条件进行分析,得出各种生物胺不同浓度所对应的峰面积。本方法所确定的试验条件下，尸胺、腐胺、精脒、精胺在0.01～0.1 μg/ml内，色胺在0.05～0.5μg/ml内，酪胺在0.08～0.8 μg/ml内，组胺在0.25～2.5内，含量（X，μg/ml）与峰面积（Y）有良好的线性关系，回归方程如下：
色胺：Y=1235463 X+42541.91 r＝0.9996
腐胺：Y=5764926 X+35394.93 r＝0.9997
尸胺：Y=5563730 X+2025.41 r＝0.9996
组胺：Y=174989.3 X+46548.79 r＝0.9992
酪胺：Y=917693.2 X+43868.11 r＝0.9999
精脒：Y=7441083 X+9881.557 r＝0.9994
精胺：Y=6811590 X+35265.41 r＝0.9999
4.5方法的回收率、精密度和检测低限
对已知七种生物胺含量的鱼样品, 分别添加不同含量水平的七种生物胺,使样品中生物胺的含量：腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.004、0.02、0.04 mg/kg；色胺：0.02、0.1、0.2 mg/kg；酪胺：0.032、0.16、0.32 mg/kg；组胺：0.10、0.5、1.0 mg/kg。每个水平作6次平行试验,按本文方法进行分析。结果表明，本方法7种生物胺的平均回收率分别为:腐胺83.6～84.2%,尸胺81.4～90.9%,精脒80.9～85.3%,精胺81.0～84.4%，色胺80.0～83.8%,酪胺80.5～82.6%,组胺72.1～74.7%。
变异系数(cv%)分别为：色胺5.03～7.46,腐胺3.17～10.96，尸胺3.90～10.67，组胺0.832～3.09，酪胺5.06～6.61，精脒5.43～7.90，精胺5.13～7.18。
采用添加法, 七种生物胺的检测低限如下：腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.004mg/kg；色胺0.02 mg/kg；酪胺0.032mg/kg；组胺0.1 mg/kg。
7种生物胺的回收率和精密度满足分析要求，测定低限均满足目前进出口水产品生物胺检测要求
5结论
本研究利用GPC及固相萃取净化、柱前衍生、反相高效液相色谱分离和荧光检测器技术，研究建立水产品中七种生物胺（色胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺）的高效液相色谱检测方法。通过实验研究得到以下结论：
5.1选用GPC净化样品提取液，研究了GPC净化条件：鱼样品三氯醋酸提取，提取物用乙酸乙酯-环己烷（1+1）溶解，离心及过滤后上GPC，收集9～19min的流份。
5.2 采用固相萃取技术对衍生液进行净化，建立了固相萃取条件： ODS-C18固相萃取净化柱，6ml甲醇和6ml水活化，样液调pH值12上柱，6ml 20%浓度的丙酮-水淋洗，3ml乙腈洗脱。
5.3建立了优化的色谱分离条件： Inertsil ODS-3 C18色谱柱，荧光检测器激发波长340nm，发射波长515nm。流动相乙腈－水，梯度洗脱，流速1.0 ml/min；。该色谱条件可使7种生物胺在20分钟内得到分离。
5.4本方法所确定的试验条件下，尸胺、腐胺、精脒、精胺在0.01～0.1 μg/ml内，色胺在0.05～0.5μg/ml内，酪胺在0.08～0.8 μg/ml内，组胺在0.25～2.5内，含量（X，μg/ml）与峰面积（Y）有良好的线性关系.
5.5 本方法七种生物胺的检测低限(mg/kg)分别为: 腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.004mg/kg；色胺0.02 mg/kg；酪胺0.032mg/kg；组胺0.1 mg/kg。检测低限可满足进出口水产品中生物胺检测的需要；
5.5方法的回收率分别为:腐胺83.6～84.2%,尸胺81.4～90.9%,精脒80.9～85.3%,精胺81.0～84.4%，色胺80.0～83.8%,酪胺80.5～82.6%,组胺72.1～74.7%。变异系数(cv%)分别为：色胺5.03～7.46,腐胺3.17～10.96，尸胺3.90～10.67，组胺0.832～3.09，酪胺5.06～6.61，精脒5.43～7.90，精胺5.13～7.18。 室内回收率和精密度均满足残留分析要求。
本方法具有操作简单快速，多组分检测检测时间短、净化效果好、检测限低等优点，易于掌握和推广。可应用于我国进出口水产品检验中。
参考文献：
[1] Damaso Hornero-Mendez, Antonio Garrido-Fernandez. Biogenic amines in table olives Analysis by high-performance liquid chromatography[J]. Analyst, 1994, 119: 2037-2040.
[2] Tamim N M, Bennett L W, Shellem T A, et al. High-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in poultry carcasses.[J]. J Agric Food Chem. 2002, 50(18): 5012-5015.
[3] Romero R, Gazquez D, Bagur M G, et al. Optimization of chromatographic parameters for the determination of biogenic amines in wines by reversed-phase high performance liquid chromatography[J]. J Chromatography A. 2000, 871(1-2): 75-83.
[4] Eerola H S，Roig-Sagues A X, Hivrvi T K. Biogenic amines in finish dry sausages. Journal of Food Safety, 1998, 18:127-138.
[5] Pavel Kalac, Martin Krizek, Concentrations of five biogenic amines in Czech beers and factors affecting their formation [J]. Food Chemistry, 1997, 58: 209-214
[6]王红勇、高志贤、陶桂全、等. 鱼类食品中组胺的简易检测法[J]. 肉品卫生, 1996, 254（7）：8-9.
[7] FDA , Fed. Reg. 1982, 470: 40487
[8] Veciana-Nogues M T, Hernandez-Jover T, Marine-Font A, et al. Liquid chromatographic method for determination of biogenic amines in fish and fish products[J]. J AOAC Int.1995, 78(4): 1045-1050.
[9] C.W.Tabor, H. Tabor. Spermine is not essential for growth of saccharomyces cerevisiae:identification of the SPE4 gene(spermine synthase)and characterization of a spe4 deletion mutant[J]. Ann. Rev. Bichem. 1984,53(1):749-751
[10] N.Seiler. Polyamines[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1986, 157(5):379-382
[11] Béatrice Brossat, Jean Straczek, Francine Belleville et. al.. Determination of free and total polyamines in human serum and urine by ion-pairing high-performance liquid chromatography using a radial compression module : Application to blood polyamine determination in cancer patients treated or not treated with an ornithine decarboxylase inhibitor[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1983, 277(8): 87-99.
[12] 施先艳，付苓.肝硬化患者五种血浆生物胺的变化及其临床意义[J].临床肝胆病杂志,1993,9(4):198~199
[13] 邓娅，李桂明，兰燕飞. 荨麻疹患者血中组胺的测定及其意义[J].中国皮肤性病学杂志,2003,17(1):16~17
[14] S. Casal, M. B. P. P. Oliveira, M. A. Ferreira. Determination of biogenic amines in coffee by an optimized liquid chromatographic method[J]. J Liquid Chromatographic ＆ Related Technologies, 2002, 25(16): 2535-2549.
[15] M.L. Izquierdo-Pulido, M.C. Vidal-Carou, A. Marine-Font. Determination of biogenic amines in beers and their raw materials by ion-pair liquid chromatography with postcolumn derivatization[J]. Journal of AOAC international.1993,76(5):1027~1032
[16]Vale SR, Gloria MB.Determination of biogenic amines in cheese[J]. J AOAC Int.1997,80(5):1006~1012
[17] I. Rodriguez, H.K. Lee, S.F.Y. Li. Separation of biogenic amines by micellar electrokinetic chromatography [J]. Journal of Chromatography A.1996,745:255-262
[18] Kovacs A, Simon-Sarkadi L, Ganzler K. Determination of biogenic amines by capillary electrophoresi[J].J Chromatorgr A. 1999,836(2):305~313
[19] Lange J, Thomas K, Wittmann C. Comparison of a capillary electrophoresis method with high-performance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples[J]. J Chromatography B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002, 779(2): 229-239
[20] E. K. Paleologos, M.G.Kontominas. On-line SPE with surfactant accelerated on-column derivatization and MLC separation as a tool for the determination of biogenic amines in various food substrates[J]. Anal. Chem., 2004, 76: 1289-1294.
(来源：现代科学仪器|http://www.ms17.cn
生物胺广泛存在于富含蛋白质而又易于变质以及采取发酵工艺生产的食物及饮料中—即存在于水产品（主要是青皮红肉的鱼类）、肉制品、乳制品、蔬菜制品和各种酒类中[1]。食品和饮料中的生物胺是由蛋白酶作用于蛋白质生成氨基酸后，相应的氨基酸经细菌（乳酸菌、小球菌、霉菌）脱羧而来的：组胺是由组氨酸、酪胺是由酪氨酸、色胺是由色氨酸、尸胺是由赖氨酸分别形成的；腐胺由鸟氨酸或精胺形成；精脒和精胺可以在精脒合成酶和精胺合成酶催化下，通过腐胺与氨丙基的生化反应形成[2]。饮食中过度摄入生物胺能造成一些有害影响。导致一些症状的发生，如：外部血管膨胀、高血压、心悸、头痛、腹泻、呕吐、荨麻疹等[3]。Eerola等人认为发酵香肠中生物胺含量安全性标准为每千克干物质产品中的组胺和酪胺含量均小于100mg[4]。Loret等人建议啤酒中酪胺+组胺+尸胺+2-苯乙胺总含量的安全范围不超过20mg/l[5]。当鱼类产品中组胺含量达到4mg/g时，即可引起中毒。人体摄入组胺达100mg以上时，即易发生中毒，同时这也与个人体质的过敏性有关[6]。在出口贸易中欧美国家对水产品中的组胺含量提出严格要求：美国FDA限量标准为50mg/kg[7] ；欧盟限量标准为100mg/kg[8]。
生物胺残留的测定方法主要为气相色谱法和高效液相色谱法。由于许多生物胺热稳定性差，使气相色谱法的应用受到了一定的限制。因此，近年来国内外对高效液相色谱法检测生物胺残留量的研究较为活跃。但多为柱后衍生—荧光检测器检测的高效液相色谱法[9～14]。
R.T. Krause[9～10]用柱后衍生—荧光检测器检测的高效液相色谱法，还报道了[11]用柱后衍生—高效液相色谱—电化学检测器方法检测粮谷中的生物胺残留量。M. Sher Ali[12，14]用柱后衍生—荧光检测器检测的高效液相色谱法检测肝脏中的生物胺。De Kou and Hiemstra[13]用柱后衍生—荧光检测器—高效液相色谱法检测水果和蔬菜中的生物胺，并采用了固相提取技术。蒋新明用柱后衍生—荧光检测器—高效液相色谱法检测了土壤中的生物胺，样品中未经过净化直接测定。于文莲用柱后衍生—荧光检测器—高效液相色谱法检测了粮谷中的生物胺，样品净化采用的是液-液萃取方法，操作过程十分繁琐。M.L.LZQUIERDO 采用OPA（邻苯二甲醛）柱后衍生荧光检测器检测，反相离子对色谱分离啤酒中生物胺，分离时间50分钟。Vale SR采用OPA（邻苯二甲醛）柱后衍生荧光检测器检测，反相离子对色谱分离奶酪中生物胺，分离时间80分钟[15-16]。此外，黄美英采用丹酰氯衍生-聚酰胺薄膜层析测定4种多胺；I.Rodriguez采用毛细管电泳法荧光检测器检测酱油中8种生物胺；Kovacs A则采用毛细管电泳法紫外检测器检测红酒与意大利腊肠中7种生物胺，并用ACCQ衍生，检测低限远不如HPLC。另外对液-液萃取和固相萃取进行比较，证明各项参数后者都要优于前者[17-19]。
综上所述：可以看出目前国内外对生物胺的各种检测方法中，普遍存在着前处理过程烦琐、净化效果不理想、检出限低等不足。
2 实验仪器与材料
2.1 主要仪器
2.1.1 HPLC仪：美国Waters公司，配1525二元泵、2475荧光检测器、717自动进样器、TCM柱温箱、在线脱气机；
2.1.2 凝胶过滤色谱仪： AccuPrepTM J2 Scientific；
2.1.3 超纯水净化系统：法国密理博公司，mini-Q synthesis型；
2.1.4 固相萃取装置，VISIPREP；
2.1.5 氮气吹干仪：美国N-EVAP 111型；
2.1.6 北京医用离心机厂LD5-2A型离心机；
2.1.7 上海医科大学仪器厂XW-80A涡流混合器；
2.1.8 pH仪：上海雷磁仪器厂；
2.1.9 数显恒温水浴锅：金坛富华HH-2型；
2.2 试剂
所有用水均为milli-Q synthesis制备的高纯水（≥18.2MΩ）
2.2.1 甲醇：色谱纯，Fisher公司；
2.2.2 乙腈：色谱纯，Fisher公司；
2.2.3 乙酸乙酯：色谱纯，Fisher公司；
2.2.4 丙酮：色谱纯，TEDIA公司；
2.2.5 甲苯：色谱纯，TEDIA公司；
2.2.6 盐酸：优级纯；
2.2.7 磷酸：优级纯；
2.2.8 碳酸氢钠：分析纯；
2.2.9 碳酸钠：分析纯；
2.2.10 氢氧化钠：分析纯；
2.2.11 磷酸氢二钠：分析纯；
2.2.12 生物胺标准品：酪胺(tyramine)、色胺(tryptamine)、精胺(spermine)、精脒(spermidine)、腐胺(putrescine)为ACROS公司产品（纯度在97%以上）；组胺(histamine)、尸胺(cadaverine)为Fluka公司产品（纯度在97%以上）；
2.2.13 丹酰氯（Dansyl chloride）：ALDRICH公司（纯度在99%以上）；
2.2.14 碳酸钠—碳酸氢钠缓冲溶液（pH11.5）：在正常室温下于0.2 mol/ml碳酸钠溶液中滴加0.2 mol/ml碳酸氢钠溶液直至pH=11.5（用pH仪测量）；
2.2.15 0.01 mol/ml氢氧化钠溶液，配制0.01 mol/ml氢氧化钠溶液，调pH=12；
2.2.16 衍生化试剂：称取0.450g丹酰氯溶于乙腈中并定容至50 ml，经过0.45μm滤膜过滤，于冰箱-20℃下保存备用。
2.2.17 生物胺标准储备液（单标，1 mg/ml）：称取0.100g标准物溶于0.1 mol/ml盐酸溶液中，于100 ml棕色容量瓶定容至刻度（其中酪胺和色胺先用3ml甲醇溶解后再用0.1 mol/ml盐酸溶液定容至100ml），放于冰箱中4℃保存，有效期一周。
2.2.18 混合标准储备溶液：从七个单标储备液（2.2.17）中，取色胺5 ml，酪胺8 ml，组胺25 ml，腐胺、尸胺、精脒、精胺各取1ml于100ml 棕色容量瓶中，0.1 mol/ml盐酸溶液定容至刻度。
此混合标准储备溶液中各种生物胺的浓度（g/ml）：腐胺、尸胺、精脒、精胺均为10g/ml，色胺50 g/ml，酪胺80 g/ml，组胺250 g/ml，。
2.2.19 系列混合标准工作液：将混合标准储备液分别稀释1000/1，1000/2，1000/3，1000/4，1000/5，1000/10 倍，得六个不同浓度的系列混合标准工作液，现用现配。
2.2.20 ODS-C18固相萃取净化柱：Agilent公司，500mg/3ml。
2.3 试验材料
试验用水产品样品为大连产黄鱼。
3 实验方法
3.1样品的预处理
称取5g（精确至0.01g）鲅鱼样品于50ml塑料离心管中，加入15ml三氯醋酸，在匀质机上充分混匀后离心，4000r/min离心3min,上清液通过滤纸过滤接于100ml鸡心瓶中，将剩下的残余样再加入15ml三氯醋酸重复上面的操作2次。合并3次的三氯醋酸，用2mol/L NaOH中和至中性后于60℃水浴条件下减压蒸馏至干，再用10ml 1:1的乙酸乙酯和环己烷溶液溶解。静置一段时间待有醋酸盐结晶沉淀，离心，过0.45μm滤膜，清液待上GPC。
3.2 GPC净化条件
流动相：乙酸乙酯-环己烷（1+1）；
流速：4ml/min；
紫外检测波长：254nm；
进样量：5ml（过滤膜后的清液）；
收集流份：接取9～19min的流份。
将收集的流份在40℃水浴条件下减压蒸馏至近干，用乙酸乙酯-环己烷（1+1）转移到15ml塑料离心管中，40℃水浴条件下氮气吹干，加入1ml 0.1mol/L的盐酸溶解，待衍生。
3.3 衍生化
在经过GPC净化后并用盐酸溶解的1ml样液中先后加入1ml衍生剂(2.2.16)和1ml pH 11.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，在涡流混合器上混匀1 min后置于60℃水浴锅中衍生15min，衍生后取出冷却至室温等待萃取。
3.4 衍生物的固相萃取
将衍生后的离心管于40℃水浴条件下用氮气将所含的有机溶剂吹干，之后加入0.5ml 0.01M氢氧化钠溶液（pH=12）。将ODS-C18固相萃取净化柱与VISIPREP固相萃取装置相联，先用6ml甲醇洗柱后用6ml水洗柱 ；将pH值调到12的样液上柱，流速控制在0.5d/s；然用6ml 20%浓度的丙酮-水溶液淋洗萃取柱，流速控制在1 d/s；最后用3ml乙腈将生物胺衍生物洗脱，流速控制在0.5d/s。收集乙腈洗脱液于15 ml离心管中，40℃水浴条件下氮气吹干。用微量取液枪吸取1.0 ml乙腈溶解残留物。
3.5 色谱条件：
上述乙腈溶解残留物经0.45μm膜过滤,进样10μl进行HPLC分析。根据峰保留时间定性，根据峰面积外标法定量。
色谱柱：Inertsil ODS-3 C18柱，250×4.6 mm，粒度5μm
柱温：25℃；
流动相：乙腈－水；
流速：1.0 ml/min
进样量:10μl
荧光检测器波长：Ex=340nm，Em=515nm。
梯度洗脱程序：见表3-1
表3-1 梯度洗脱程序
|
时间 /min |
流量 /ml/min |
%A |
%B |
|
0 |
1 |
65 |
35 |
|
5 |
1 |
75 |
25 |
|
10 |
1 |
85 |
15 |
|
13 |
1 |
100 |
0 |
|
19 |
1 |
100 |
0 |
|
20 |
1 |
65 |
35 |
4.1 净化方法的选择
测定食品中的生物胺时提取剂的选择要满足两个条件：一是生物胺在该溶剂中有很好的溶解度；二是能够沉淀蛋白。在所有检测食品中生物胺的方法中不外乎两种提取剂：酸和有机溶剂。德国人Lange、Thomas 和 Wittmann对提取各种食品中生物胺的提取剂做了研究发现：三氯醋酸对鱼类、肉类、香肠、火腿、罐装泡菜提取时除蛋白效果好净化结果理想；盐酸对各种奶酪提取时除蛋白效果好净化结果理想[19]。本文比较了三氯醋酸、高氯酸、盐酸和甲醇在提取鲅鱼中生物胺时的效果，发现三氯醋酸净化效果较好。
本文研究选用GPC净化样品提取液，试验研究了GPC净化条件，将生物胺标准溶液、鱼样品、加标的鱼样品按样品提取方法进行提取，氮气吹干后，乙酸乙酯-环己烷（1+1）溶解，离心，过0.45μm滤膜，清液上GPC。在流动相流速4ml/min 条件下，大分子干扰物质在4～8分钟出峰，生物胺标准出峰时间为9～15分钟。因此，用GPC净化时应收集9～15 分钟流份。为保证回收率，确定为收集9～19 分钟流份。
4.2 柱前衍生条件的选择
生物胺即没有荧光发色基团也没有紫外发色基团，但是丹酰氯可以同伯胺或仲胺基上的活泼氢反应,脱掉一分子的HCl生成具有荧光和紫外光的衍生物，反应式如下：
R1R2-NH2 + Dansyl-Cl →R1R2NH-Dansyl + HCl
在这一反应过程中起决定性作用的条件有四个：衍生剂的浓度、pH值、衍生温度、衍生时间[20]。
4.2.1 衍生剂的浓度
在不改变其它反应条件只改变衍生剂的浓度的条件下，做了14组实验，每组做3次平行实验取3次测量的平均值，结果如图1：
从图1中可以看出衍生剂浓度在9mg/ml时，七种生物胺衍生效果最好，丹酰氯衍生物的量最多。大于9mg/ml浓度时生物胺衍生物的生成量无明显变化而且会造成试剂的浪费。
4.2.2buffer的pH值
生物胺和衍生剂要在碱性条件下才能发生反应，选择一个合适pH的buffer至关重要。本文选取了碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液体系，配制了不同pH的缓冲溶液进行实验研究，结果如图2：
由图2可以得出色胺、腐胺、尸胺在buffer的pH=9时有最大生成量，之后随着pH值的增加而略减少而当pH值增加到11.5时，生物胺的生成量与pH=9.5时基本相当；其它4种生物胺都是在pH=11.5时有最大生成量。因此，综合考虑生物胺衍生反应中buffer的pH为11.5。
4.2.3 衍生温度与时间
关于生物胺衍生的衍生温度与时间问题，以往的研究比较多，但结论不统一。 作者按照表1衍生温度和时间条件进行了实验，不同条件下七种生物胺的生成量同最稳定的室温隔夜条件下的七种生物胺生成量相比结果相似。但从省时节能方面来考虑，60℃水浴15min是比较合适的衍生条件，可以满足日常的一般检验。
表1：衍生温度与对应的时间
|
温度（℃） |
时间（min） |
温度（℃） |
时间（min） |
|
室温 |
隔夜 |
37 |
60 |
|
40 |
30 |
40 |
60 |
|
50 |
30 |
60 |
12 |
|
60 |
15 |
60 |
30 |
|
65 |
10 |
65 |
30 |
|
70 |
10 |
70 |
15 |
|
75 |
10 |
85 |
10 |
4.3 色谱分离条件的选择
本方法采用国产Spherisorb C8柱，通过选择流动相乙腈和水的配比，建立了表3-1的梯度洗脱条件，在此条件下，在20分钟内完成7种生物胺的分离，色谱分离效果很好。标准溶液、加标鱼样品和鱼样品色谱图分别见图3、图4和图5。
从图3可见，7种生物胺得到完全分离，色谱分离效果非常好，分离度符合要求。
比较图4和图5可见，在样品色谱图上无干扰峰存在。说明在本方法所确定的试验条件下，样品净化效果好，可满足检测要求。
图3. 7种生物胺标准色谱图
1. 色胺9.496;2. 腐胺11.620;3.尸胺12.426;4.组胺13.212;
5.酪胺16.271;6.精脒16.742;7.精胺19.199.
单位:min
图4. 鱼样品添加生物胺标准样品色谱图
注：图中 腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.04mg/kg；
色胺0.2 mg/kg；酪胺0.32mg/kg；组胺1.0 mg/kg
图5. 鱼样品色谱图
各种生物胺含量（mg/kg）：色胺0.015,腐胺0.00093,尸胺0.0044,组胺0.034,酪胺0.045,精脒0.0078,精胺0.0054。
4.4 线性关系试验
将混合标准储备液分别稀释1000/1，1000/2，1000/3，1000/4，1000/5，1000/10 倍，得六个不同浓度的系列混合标准工作液，按上述色谱条件进行分析,得出各种生物胺不同浓度所对应的峰面积。本方法所确定的试验条件下，尸胺、腐胺、精脒、精胺在0.01～0.1 μg/ml内，色胺在0.05～0.5μg/ml内，酪胺在0.08～0.8 μg/ml内，组胺在0.25～2.5内，含量（X，μg/ml）与峰面积（Y）有良好的线性关系，回归方程如下：
色胺：Y=1235463 X+42541.91 r＝0.9996
腐胺：Y=5764926 X+35394.93 r＝0.9997
尸胺：Y=5563730 X+2025.41 r＝0.9996
组胺：Y=174989.3 X+46548.79 r＝0.9992
酪胺：Y=917693.2 X+43868.11 r＝0.9999
精脒：Y=7441083 X+9881.557 r＝0.9994
精胺：Y=6811590 X+35265.41 r＝0.9999
4.5方法的回收率、精密度和检测低限
对已知七种生物胺含量的鱼样品, 分别添加不同含量水平的七种生物胺,使样品中生物胺的含量：腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.004、0.02、0.04 mg/kg；色胺：0.02、0.1、0.2 mg/kg；酪胺：0.032、0.16、0.32 mg/kg；组胺：0.10、0.5、1.0 mg/kg。每个水平作6次平行试验,按本文方法进行分析。结果表明，本方法7种生物胺的平均回收率分别为:腐胺83.6～84.2%,尸胺81.4～90.9%,精脒80.9～85.3%,精胺81.0～84.4%，色胺80.0～83.8%,酪胺80.5～82.6%,组胺72.1～74.7%。
变异系数(cv%)分别为：色胺5.03～7.46,腐胺3.17～10.96，尸胺3.90～10.67，组胺0.832～3.09，酪胺5.06～6.61，精脒5.43～7.90，精胺5.13～7.18。
采用添加法, 七种生物胺的检测低限如下：腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.004mg/kg；色胺0.02 mg/kg；酪胺0.032mg/kg；组胺0.1 mg/kg。
7种生物胺的回收率和精密度满足分析要求，测定低限均满足目前进出口水产品生物胺检测要求
5结论
本研究利用GPC及固相萃取净化、柱前衍生、反相高效液相色谱分离和荧光检测器技术，研究建立水产品中七种生物胺（色胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺）的高效液相色谱检测方法。通过实验研究得到以下结论：
5.1选用GPC净化样品提取液，研究了GPC净化条件：鱼样品三氯醋酸提取，提取物用乙酸乙酯-环己烷（1+1）溶解，离心及过滤后上GPC，收集9～19min的流份。
5.2 采用固相萃取技术对衍生液进行净化，建立了固相萃取条件： ODS-C18固相萃取净化柱，6ml甲醇和6ml水活化，样液调pH值12上柱，6ml 20%浓度的丙酮-水淋洗，3ml乙腈洗脱。
5.3建立了优化的色谱分离条件： Inertsil ODS-3 C18色谱柱，荧光检测器激发波长340nm，发射波长515nm。流动相乙腈－水，梯度洗脱，流速1.0 ml/min；。该色谱条件可使7种生物胺在20分钟内得到分离。
5.4本方法所确定的试验条件下，尸胺、腐胺、精脒、精胺在0.01～0.1 μg/ml内，色胺在0.05～0.5μg/ml内，酪胺在0.08～0.8 μg/ml内，组胺在0.25～2.5内，含量（X，μg/ml）与峰面积（Y）有良好的线性关系.
5.5 本方法七种生物胺的检测低限(mg/kg)分别为: 腐胺、尸胺、精脒、精胺均为0.004mg/kg；色胺0.02 mg/kg；酪胺0.032mg/kg；组胺0.1 mg/kg。检测低限可满足进出口水产品中生物胺检测的需要；
5.5方法的回收率分别为:腐胺83.6～84.2%,尸胺81.4～90.9%,精脒80.9～85.3%,精胺81.0～84.4%，色胺80.0～83.8%,酪胺80.5～82.6%,组胺72.1～74.7%。变异系数(cv%)分别为：色胺5.03～7.46,腐胺3.17～10.96，尸胺3.90～10.67，组胺0.832～3.09，酪胺5.06～6.61，精脒5.43～7.90，精胺5.13～7.18。 室内回收率和精密度均满足残留分析要求。
本方法具有操作简单快速，多组分检测检测时间短、净化效果好、检测限低等优点，易于掌握和推广。可应用于我国进出口水产品检验中。
参考文献：
[1] Damaso Hornero-Mendez, Antonio Garrido-Fernandez. Biogenic amines in table olives Analysis by high-performance liquid chromatography[J]. Analyst, 1994, 119: 2037-2040.
[2] Tamim N M, Bennett L W, Shellem T A, et al. High-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in poultry carcasses.[J]. J Agric Food Chem. 2002, 50(18): 5012-5015.
[3] Romero R, Gazquez D, Bagur M G, et al. Optimization of chromatographic parameters for the determination of biogenic amines in wines by reversed-phase high performance liquid chromatography[J]. J Chromatography A. 2000, 871(1-2): 75-83.
[4] Eerola H S，Roig-Sagues A X, Hivrvi T K. Biogenic amines in finish dry sausages. Journal of Food Safety, 1998, 18:127-138.
[5] Pavel Kalac, Martin Krizek, Concentrations of five biogenic amines in Czech beers and factors affecting their formation [J]. Food Chemistry, 1997, 58: 209-214
[6]王红勇、高志贤、陶桂全、等. 鱼类食品中组胺的简易检测法[J]. 肉品卫生, 1996, 254（7）：8-9.
[7] FDA , Fed. Reg. 1982, 470: 40487
[8] Veciana-Nogues M T, Hernandez-Jover T, Marine-Font A, et al. Liquid chromatographic method for determination of biogenic amines in fish and fish products[J]. J AOAC Int.1995, 78(4): 1045-1050.
[9] C.W.Tabor, H. Tabor. Spermine is not essential for growth of saccharomyces cerevisiae:identification of the SPE4 gene(spermine synthase)and characterization of a spe4 deletion mutant[J]. Ann. Rev. Bichem. 1984,53(1):749-751
[10] N.Seiler. Polyamines[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1986, 157(5):379-382
[11] Béatrice Brossat, Jean Straczek, Francine Belleville et. al.. Determination of free and total polyamines in human serum and urine by ion-pairing high-performance liquid chromatography using a radial compression module : Application to blood polyamine determination in cancer patients treated or not treated with an ornithine decarboxylase inhibitor[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1983, 277(8): 87-99.
[12] 施先艳，付苓.肝硬化患者五种血浆生物胺的变化及其临床意义[J].临床肝胆病杂志,1993,9(4):198~199
[13] 邓娅，李桂明，兰燕飞. 荨麻疹患者血中组胺的测定及其意义[J].中国皮肤性病学杂志,2003,17(1):16~17
[14] S. Casal, M. B. P. P. Oliveira, M. A. Ferreira. Determination of biogenic amines in coffee by an optimized liquid chromatographic method[J]. J Liquid Chromatographic ＆ Related Technologies, 2002, 25(16): 2535-2549.
[15] M.L. Izquierdo-Pulido, M.C. Vidal-Carou, A. Marine-Font. Determination of biogenic amines in beers and their raw materials by ion-pair liquid chromatography with postcolumn derivatization[J]. Journal of AOAC international.1993,76(5):1027~1032
[16]Vale SR, Gloria MB.Determination of biogenic amines in cheese[J]. J AOAC Int.1997,80(5):1006~1012
[17] I. Rodriguez, H.K. Lee, S.F.Y. Li. Separation of biogenic amines by micellar electrokinetic chromatography [J]. Journal of Chromatography A.1996,745:255-262
[18] Kovacs A, Simon-Sarkadi L, Ganzler K. Determination of biogenic amines by capillary electrophoresi[J].J Chromatorgr A. 1999,836(2):305~313
[19] Lange J, Thomas K, Wittmann C. Comparison of a capillary electrophoresis method with high-performance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples[J]. J Chromatography B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002, 779(2): 229-239
[20] E. K. Paleologos, M.G.Kontominas. On-line SPE with surfactant accelerated on-column derivatization and MLC separation as a tool for the determination of biogenic amines in various food substrates[J]. Anal. Chem., 2004, 76: 1289-1294.
关注本网官方微信 随时阅权威资讯
