LC/MS/MS法测定化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺

　Determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS)

Du Yegang, Lin Shaobin
National Institute for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China

Abstract: Objective To explore the determination methods of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics. Methods 12 samples were quantitatively analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Results NDELA was linear in the range 0-1000 ng/ml and the linear correlation coefficient reached 0.9996; the minimum detection limit was 0.2 ng/ml. The spiked recovery was from 81% to 103%, and the RSD was between 2.47-8.33%. NDELA was measured in five out of 12 samples. The ratio was 41.7% and the minimum concentration was 0.652 µg/kg and the maximum was 24.2 µg/kg. Conclusion The method possessed fairly high sensitivity and good specificity.
Key words：Cosmetics, N-nitrosodiethanolamine, LC/MS/MS, determination

亚硝基化合物是一类很强烈的化学致癌物质，能诱发许多动物的恶性肿瘤。1977年，Fan 等报道在化妆品中发现了亚硝胺[1]。亚硝胺可经皮肤吸收进入人体，有研究发现，皮肤接触化妆品后，在尿中能检出N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）[2]。化妆品中亚硝胺的监测已成为化妆品工业中一个令人关注的主要问题。
由于化妆品中亚硝胺的种类繁多，化学结构和性质多样，而且在分析过程中有可能生成新的亚硝胺，产生假阳性干扰,影响测定结果的可靠性，因此，化妆品中的亚硝胺的测定是比较困难的。国外对亚硝胺的检测报道过多种方法[3-8]，化学荧光、极谱法、毛细管电泳和分光光度法等都有使用的报道，极谱法、毛细管电泳和分光光度法等受自身条件的限制应用并不普遍，相比较来说HPLC和GC的应用最为广泛。然而，这些方法或多或少都还存在着一定的缺陷，因此需要我们进一步完善化妆品中亚硝胺的检测方法，提出更有效、更可靠的检测方法。

1. 仪器及试剂
1.1 仪器及工作参数
1.1.1 仪器
Extrelut®NT20液液萃取柱（德国Merck公司）；
振荡均匀器；
Gilson精密移液器（200µl,1000µl，5000µl）；
电子分析天平；
K-D浓缩器；
LC\MS\MS API 4000（美国AB公司）：
1.1.2 工作参数
质谱部分
真空度：3.3e-5Torr
离子源：ESI离子源
扫描极性：Positive
离子源温度：200℃

色谱部分
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8(4.6*150mm,5µm)
柱温：室温
进样量：10µl
流动相：100％甲醇
流速：300µl/min
总时间：7min
1.2 试剂
N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）标准品（SIGMA公司）；甲醇（色谱级，Fisher公司）；二氯甲烷（色谱级，Fisher公司）；环己烷（分析纯，北京化学试剂公司）；乙酸乙脂（色谱级，Fisher公司）

2. 实验方法
2.1 样品的选择
并不是所有的化妆品中都会含有亚硝胺，这就要求我们对所要检测的样品进行初步的筛选。化妆品在制作和放置过程中由于一些可能形成亚硝胺的前体物质被亚硝化而形成亚硝胺是化妆品中亚硝胺的主要来源。查阅化妆品配方,挑选可能含有NDELA的化妆品作为实验样品。
2.2 样品前处理[9][10]
称取2g左右化妆品，加入9ml蒸馏水，再加入0.5g氨基磺酸钠作为亚硝胺抑制剂，充分振荡摇匀，然后加入1gNaCl和1.5ml氯仿，超声振荡30min，然后将样品溶液加载于Extrelut®NT20液相萃取柱上，容器用5ml蒸馏水清洗后也加载到萃取柱上，平衡20min后，用100ml环己烷：二氯甲烷（1:1 v/v）清洗，然后用100ml乙酸乙脂洗脱，洗脱液收集在收集瓶内，用K-D浓缩器在N2气保护下减压浓缩至干，残留物溶解在1ml甲醇中，然后进样分析。如有混浊需经0.2μm滤膜过滤后再进样分析。
2.3 标准曲线的绘制
分别称取一定量的亚硝胺标准物质，加入少量甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，用甲醇定容，配制单标储备液，将储备液于0~4℃保存。储备液用甲醇稀释至200μg/ml作为中间使用液，一并于0~4℃下密闭保存，使用时根据实际需要稀释。中间液用甲醇稀释至1μg/ml左右用于选择质谱和色谱条件时使用。
把中间使用液用甲醇准确稀释成0、1ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml浓度系列，分别测定各标准溶液的色谱峰，以峰面积对相应的浓度作图，得到标准曲线，并求出回归方程。
2.4 样品测定
实际样品经前处理后，按仪器条件进样分析。
2.5 结果计算
按下式计算样品中各亚硝胺的浓度：
ω＝
式中：ω—样品中各亚硝胺的质量分数，μg/kg；
ρ—测定样品中各亚硝胺的质量浓度，ng/ml；
V—样品定容体积，ml；
M—样品质量，g。

3. 结果与讨论
3.1 线性范围和检出限
NDELA在0－1000ng/ml范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9996。以信噪比S/N＝3为检出限的判断标准，求得检出限为0.2μg/kg。
3.2 回收率
称取2g左右样品，分别加入10 ng/ml 和1000 ng/ml 的NDELA标准溶液200μl，经样品前处理后进样分析，每个浓度平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差。
表1 回收率测定结果
Table 1 The results of recovery
3.3 精密度
往10ml空白溶液中各分别加入10 ng/ml和10000 ng/ml的NDELA标准溶液100μl，经样品前处理后进样分析，在一天内每个浓度平行测定6次，计算其相对标准偏差分别为3.45%和2.47%。
往10ml空白溶液中各分别加入10 ng/ml和10000 ng/ml的NDELA标准溶液100μl，经样品前处理后进样分析，在一天内每个浓度测定1次，连续测定6天，计算其相对标准偏差分别为8.33%和3.13%。
3.4 实际样品检测结果
称取2g左右样品，经前处理后进样分析，每个样品连续进样3次，取平均值，计算相对标准偏差，结果如表2所示。
表2 实际样品检测结果
Table 2 NDELA content of 12 cosmetic samples
3.5 讨论
3.5.1 质谱条件的选择
NDELA是极性化合物，实验中选用ESI离子源，用阳离子模式在m/z 0—200范围内进行Q1扫描，得出NDELA的母离子为m/z 135.2（[M+H]+），见图1。然后进行子离子扫描得出两个较强的子离子m/z 104.2和m/z74.1，见图2。选择上述两对离子对后，对各质谱参数进行优化,结果如下表。
表3 NDELA质谱参数优化结果
Table 3 The mass parameters of NDELA

化合物	离子对	DP	CE	CUR	GS1	GS2	CAD	TEM
NDELA	135.2/104.2	32	8	17	20	30	5	200
	135.2/74.1	32	15

图1 NDELA的Q1扫描图
Fig. 1. The Q1 scan spectra of NDELA


图2 NDELA的子离子扫描图
Fig. 2. The Product-ion spectra of NDELA


3.5.2 色谱条件的选择
实验中对C8和C18柱进行比较发现两种柱子对NDELA的出峰强度没有明显的区别，而C8柱出峰较快（Rt=4.75min），实验中选择使用了C8柱。
在选择流动相时发现，当在选取NH4Ac做缓冲液时，随着NH4Ac的增加峰形变差，变弱；流动相中加入H2O时，随着H2O的增加，峰拖尾严重，在使用CH3CN、CH3COOH缓冲液等不同配比下出峰情况也不理想，而在100％甲醇为流动相的条件下NDELA的峰形和灵敏度都比较理想，所以本实验选取100％甲醇作为流动相。在所选择仪器条件下NDELA的标准色谱图如图3所示。


图3 NDELA标准溶液色谱图（100ng/ml）
Fig. 3. Mass chromatogram of NDELA standard (100ng/ml)

3.5.3 前处理方法的选择
实验过程中尝试使用固相萃取、溶剂萃取等多种前处理方法，结果表明在使用Extrelut®NT液相萃取柱进行萃取时得到较高的回收率。所以实验中选择使用Extrelut®NT液相萃取柱，乙酸乙脂洗脱的方法来进行前处理。
4. 结论
本实验所建立的方法灵敏度高（检出限低至0.2μg/kg），选择性好，结果准确可靠。
参考文献：
1.郑星泉：化妆品中亚硝胺的现状及监测方法，中国环境卫生，2000，3（001）：32-37
2. 胡荣梅 马立珊：《N-亚硝基化合物分析方法》，科学出版社（1980）
3.Schothorst,R.C. & Stephany,R.W.：Occurrence of N-Nitrosodiethanolamine(NDELA) in cosmetics from the Dutch market,intern. J. Of cosmetic Sci.2001,23：109-114
4.Schwarzenbach, R & Schmid, JP： High-performance liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry as alternative methods to chemiluminescence detection, J.Chromatogr,472(1989)：231-242
5.Matyska,MT; Pesek,JJ&Yang,L： Screening method for determining the presence of N-Nitrosodiethanolamine in cosmetics by open-tubular capillary electrochromatography, J.Chromatogr A,887(2000)：497-503
6.Fukuda,Y; Morikawa,Y&Matsumoto,I： Ion-exchange chromatographic separation of N-Nitrosodiethanolamine in cosmetics, Anal.Chem.1981,53：2000-2003
7.Chou,HJ; Yates,RL; Gajan,RL&Davis,HM： Differential Pulse Polarographic Determination of N-Nitrosodiethanolamine in Cosmetic Products, J.AOAC intern.1982,65(4)：850-854
8.Chou,HJ;Yates,RL & Wenninger,JA：Screening cosmetic products for N-Nitroso compounds by chemiluminescent determination of Nitric Oxide, J.AOAC intern.1987,70(6)：960-963
9.Schothorst, R.C. & Stephany, R.W.：Occurrence of N-Nitrosodiethanolamine(NDELA) in cosmetics from the Dutch market, intern. J. Of cosmetic Sci. 2001, 23：109-114
10.Schwarzenbach, R & Schmid, JP： High-performance liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry as alternative methods to chemiluminescence detection, J.Chromatogr, 472(1989)：231-242