ALLIANCE连续自动分析仪水溶性糖检测方法的改进研究
A Improved Study On Determination of Water Soluble Sugars of ALLIANCE automatic continuous analyzer
TANG XUE-MEI
Beijing Jiaotong University, Beijing, 100044,China
Beijing Tobacco Quality Supervision and Test Station, Beijing 100029,China
E-mail： lg289@sina.com
Keywords：Tobacco、Water Soluble Sugars、Continuous Flow Method
Abstract: In 2002, China Tobacco Monopoly Bureau released Tobacco and Tobacco Products---Determination of Water Soluble Sugars---Continuous Flow Method as industrial criteria. In order to meet to the requirements of the industrial criteria with, the determination method for the water soluable sugars was improved. The instrument was also modified. It was proved that the improved method had very good repeatability and was accurate and applicable.
法国生产的ALLIANCE连续自动分析仪已在很多烟草质检站使用，大多数的ALLIANCE自动分析仪是前几年购买的，水溶性糖检测使用的是新亚铜方法[3]，2002年发布的烟草行业标准YC/T159——2002规定了烟草中水溶性糖的测定方法是利用糖与对羟基苯甲酸酰肼（4-Hydroxybenzhydrazide,简称PAHBAH）反应（简称PB法），两种方法反应原理不同，检测结果有一定差异。为了适应新的行业标准要求，同时又充分利用现有仪器，我们决定对现有的ALLIANCE连续自动分析仪水溶性糖检测通道及检测方法进行改造。
1.原理
新亚铜法是用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的糖在92℃，酸性条件下水解成单糖，水解后的糖溶液与新亚铜反应，生成黄色物质，于460 nm波长下测定。PB法是用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的糖在95℃，酸性条件下水解，水解后的糖溶液在85℃碱性介质中与对羟基苯甲酸酰肼发生成脎反应，生成黄色的偶氮化合物，在410 nm波长下测定。相同点：这两种方法所用的萃取液相同，因此进样部分不需改动。
我们知道一个化学反应如果试剂加入顺序、反应条件相同，试剂加入量充分，反应就能定量完成。因此，我们可以参照行业标准的反应模式进行仪器改造。
1.1管线部分
仪器化学反应管线流路我们可以参照YC/T159——2002 图1 水溶性糖测定管路图。 由于所使用的仪器不同，试剂的进样量有差异，我们通过调整各个管线的内径和所用溶液浓度，使改造后的反应试剂量是足够的。因为我们使用的仪器中所有玻璃螺旋管和最终的流动比色池内径是不可改变的，所以在管线内径选择上，既要选择现有的泵管内径规格又要综合考虑整个反应流路的平衡，使化学反应平稳进行。
1.2溶液浓度
我们可以根据PB法检测原理及YC/T159——2002反应条件推算出行业标准采用的反应条件，根据此反应条件确定改造后各种试剂浓度，使之与行业标准基本一致。
1.2.1.检测样品萃取液进行水解的条件：温度95℃，
1.2.2.检测样品萃取液量与5%对羟基苯甲酸酰肼溶液比例关系为V2：V6=0.6：0.23=2.6
检测样品萃取液量与0.008mol/L氯化钙的比例关系为V2：V3=0.6：0.16=3.75
1.2.3.成脎反应时氢氧化钠的浓度
注：V1：YC/T159——2002 4.7水解加入的盐酸流量，0.80ml/min
N1：YC/T159——2002 4.7水解加入的盐酸浓度,1.0mol/L
V2: 加入的样品流量,0.60ml/ min
V3：YC/T159——2002 4.3 0.008mol/L氯化钙溶液流量，0.16ml/ min
V4：YC/T159——2002 4.8 氢氧化钠流量，0.80 ml/ min
N4：YC/T159——2002 4.8 氢氧化钠的浓度，1.0 mol/L
V5：YC/T159——2002 4.2 氢氧化钠流量2.0 ml/ min
N5：YC/T159——2002 4.2 氢氧化钠的浓度0.5 mol/L
V6：YC/T159——2002 4.9 PAHBAH溶液流量，0.23 ml/ min
N6：YC/T159——2002 4.9 溶解PAHBAH溶液的盐酸浓度0.5 mol/L
1.3其它
1.3.1PB法需要两个加热池，水解加热池温度95℃，成脎反应加热池温度85℃。
1.3.2由于两种方法产生最终产物不同，PB法检测用最大吸收波长为410 nm。
2.材料与方法
2.1材料：盐酸，氢氧化钠，氯化钙，均为分析纯；葡萄糖、对羟基苯甲酸酰肼为SIGMA公司产品，标准物质GBW08514，实验中所用蒸馏水由国家标准物质中心提供。检测中用的样品为北京卷烟厂的卷烟产品。
2.2方法：仪器化学反应管线参考YC/T159——2002 图1 水溶性糖测定管路图，结合现使用仪器情况进行改造，使改造后各种化学试剂的加样次序与行业标准相同。改造后的管线图如下（图1）。
图1. 改造后的水溶性糖测定管路图
注：图中管线颜色及流量为行业标准，ni \Ri为改造后试剂浓度及管径
2.2.1 ALLIANCE连续自动分析仪同一检测通道各条管线的流速是相同的，通过反复计算和实验，我们确定了各条管线的内径和所用试剂的浓度，上图中R、R1、R2 、R3 、R4 、R5、R6和n1 、n2 、n3 、n4 、n5、n6分别为对应管线的直径及试剂浓度（n6为溶解PB试剂的盐酸浓度）。用这些浓度的试剂可以使得糖水解时盐酸浓度和成脎反应时氢氧化钠的浓度与行业标准相同。R= 0.25mm, R1=1.42mm、R2 =0.38mm、R3 =0.38mm、R4 =0.38mm、R5=1.52mm 、R6=0.64mm。n1 =0.61 mol/L、n2 =N2、n3 =N3 、n4 =1.8 mol/L、n5 = 0.96mol/L、n6=0.61mol/L
.检测样品与5%对羟基苯甲酸酰肼溶液比例关系为：
（R2/2） v:（R6/2） v =R2 ：R6 =0.38 ：0.64 =0.35
检测样品与0.008mol/L氯化钙的比例关系为：
（R2/2） v:（R3/2） v =R2 ： R3 =0.38 ：0.38 =1
与行业标准相比：5%对羟基苯甲酸酰肼溶液和0.008mol/L氯化钙溶液在反应中都是过量的。
2.3.1 加热池改造：我们利用该套仪器氯检测通道不使用的加热池做为成脎反应加热池，将设定温度调至所需85℃。原有的加热池做为水解加热池，按新标准将设定温度调至95℃。
2.4.1 滤光片：将原仪器使用的460nm滤光片，按新标准换为410 nm滤光片。
3.结果与结论
3.1结果
改造后，我们按YC/T159——2002中4.11配制葡萄糖浓度为0.6g /L、1.2g /L、1.8 g/L 、2.4g/L 、3.0 g /L的5个工作标准溶液，依据YC/T159——2002中6 分析步骤 对仪器做了实验验证。
3.1.1准确度：用标准物质GBW08514（总糖标准值18.8%，不确定度0.8%）按仪器检测要求制样，做平行实验，所得结果如下（表1）：
表1. 方法的准确度实验结果
3.1.2重复性
将五个样品按仪器检测要求制样，每个样品在仪器上检测五次，所得检测结果处理见表2：
表2. 方法的重复性实验结果（n=5）
3.1.3方法的回收率实验
用3种不同的样品分别加入0.0452 g 的葡萄糖糖，经实验测得回收率结果如下（表3）。
表3. 方法回收率实验结果
3.2结论
从以上实验结果可以看出，准确性实验中标准物质检测结果在不确定度的范围内；重复性测试最大相对偏差为1.05%，变异系数最大为0.007；回收率为97.79%-----104.2%。改造后仪器性能良好。检测原理与反应条件满足行业标准要求。因此，这种改造是可行的。
参考文献
1.中华人民共和国烟草行业标准YC/T——2002《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》 国家烟草专卖局发布 中国标准出版社出版 2002
2.徐积功编 有机化学基础 高等教育出版社出版 1991
3.新亚铜法： 由仪器生产厂商法国ALLIANCE提供
(来源：现代科学仪器|http://www.ms17.cn
TANG XUE-MEI
Beijing Jiaotong University, Beijing, 100044,China
Beijing Tobacco Quality Supervision and Test Station, Beijing 100029,China
E-mail： lg289@sina.com
Keywords：Tobacco、Water Soluble Sugars、Continuous Flow Method
Abstract: In 2002, China Tobacco Monopoly Bureau released Tobacco and Tobacco Products---Determination of Water Soluble Sugars---Continuous Flow Method as industrial criteria. In order to meet to the requirements of the industrial criteria with, the determination method for the water soluable sugars was improved. The instrument was also modified. It was proved that the improved method had very good repeatability and was accurate and applicable.
法国生产的ALLIANCE连续自动分析仪已在很多烟草质检站使用，大多数的ALLIANCE自动分析仪是前几年购买的，水溶性糖检测使用的是新亚铜方法[3]，2002年发布的烟草行业标准YC/T159——2002规定了烟草中水溶性糖的测定方法是利用糖与对羟基苯甲酸酰肼（4-Hydroxybenzhydrazide,简称PAHBAH）反应（简称PB法），两种方法反应原理不同，检测结果有一定差异。为了适应新的行业标准要求，同时又充分利用现有仪器，我们决定对现有的ALLIANCE连续自动分析仪水溶性糖检测通道及检测方法进行改造。
1.原理
新亚铜法是用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的糖在92℃，酸性条件下水解成单糖，水解后的糖溶液与新亚铜反应，生成黄色物质，于460 nm波长下测定。PB法是用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的糖在95℃，酸性条件下水解，水解后的糖溶液在85℃碱性介质中与对羟基苯甲酸酰肼发生成脎反应，生成黄色的偶氮化合物，在410 nm波长下测定。相同点：这两种方法所用的萃取液相同，因此进样部分不需改动。
我们知道一个化学反应如果试剂加入顺序、反应条件相同，试剂加入量充分，反应就能定量完成。因此，我们可以参照行业标准的反应模式进行仪器改造。
1.1管线部分
仪器化学反应管线流路我们可以参照YC/T159——2002 图1 水溶性糖测定管路图。 由于所使用的仪器不同，试剂的进样量有差异，我们通过调整各个管线的内径和所用溶液浓度，使改造后的反应试剂量是足够的。因为我们使用的仪器中所有玻璃螺旋管和最终的流动比色池内径是不可改变的，所以在管线内径选择上，既要选择现有的泵管内径规格又要综合考虑整个反应流路的平衡，使化学反应平稳进行。
1.2溶液浓度
我们可以根据PB法检测原理及YC/T159——2002反应条件推算出行业标准采用的反应条件，根据此反应条件确定改造后各种试剂浓度，使之与行业标准基本一致。
1.2.1.检测样品萃取液进行水解的条件：温度95℃，
1.2.2.检测样品萃取液量与5%对羟基苯甲酸酰肼溶液比例关系为V2：V6=0.6：0.23=2.6
检测样品萃取液量与0.008mol/L氯化钙的比例关系为V2：V3=0.6：0.16=3.75
1.2.3.成脎反应时氢氧化钠的浓度
注：V1：YC/T159——2002 4.7水解加入的盐酸流量，0.80ml/min
N1：YC/T159——2002 4.7水解加入的盐酸浓度,1.0mol/L
V2: 加入的样品流量,0.60ml/ min
V3：YC/T159——2002 4.3 0.008mol/L氯化钙溶液流量，0.16ml/ min
V4：YC/T159——2002 4.8 氢氧化钠流量，0.80 ml/ min
N4：YC/T159——2002 4.8 氢氧化钠的浓度，1.0 mol/L
V5：YC/T159——2002 4.2 氢氧化钠流量2.0 ml/ min
N5：YC/T159——2002 4.2 氢氧化钠的浓度0.5 mol/L
V6：YC/T159——2002 4.9 PAHBAH溶液流量，0.23 ml/ min
N6：YC/T159——2002 4.9 溶解PAHBAH溶液的盐酸浓度0.5 mol/L
1.3其它
1.3.1PB法需要两个加热池，水解加热池温度95℃，成脎反应加热池温度85℃。
1.3.2由于两种方法产生最终产物不同，PB法检测用最大吸收波长为410 nm。
2.材料与方法
2.1材料：盐酸，氢氧化钠，氯化钙，均为分析纯；葡萄糖、对羟基苯甲酸酰肼为SIGMA公司产品，标准物质GBW08514，实验中所用蒸馏水由国家标准物质中心提供。检测中用的样品为北京卷烟厂的卷烟产品。
2.2方法：仪器化学反应管线参考YC/T159——2002 图1 水溶性糖测定管路图，结合现使用仪器情况进行改造，使改造后各种化学试剂的加样次序与行业标准相同。改造后的管线图如下（图1）。
图1. 改造后的水溶性糖测定管路图
注：图中管线颜色及流量为行业标准，ni \Ri为改造后试剂浓度及管径
2.2.1 ALLIANCE连续自动分析仪同一检测通道各条管线的流速是相同的，通过反复计算和实验，我们确定了各条管线的内径和所用试剂的浓度，上图中R、R1、R2 、R3 、R4 、R5、R6和n1 、n2 、n3 、n4 、n5、n6分别为对应管线的直径及试剂浓度（n6为溶解PB试剂的盐酸浓度）。用这些浓度的试剂可以使得糖水解时盐酸浓度和成脎反应时氢氧化钠的浓度与行业标准相同。R= 0.25mm, R1=1.42mm、R2 =0.38mm、R3 =0.38mm、R4 =0.38mm、R5=1.52mm 、R6=0.64mm。n1 =0.61 mol/L、n2 =N2、n3 =N3 、n4 =1.8 mol/L、n5 = 0.96mol/L、n6=0.61mol/L
.检测样品与5%对羟基苯甲酸酰肼溶液比例关系为：
（R2/2） v:（R6/2） v =R2 ：R6 =0.38 ：0.64 =0.35
检测样品与0.008mol/L氯化钙的比例关系为：
（R2/2） v:（R3/2） v =R2 ： R3 =0.38 ：0.38 =1
与行业标准相比：5%对羟基苯甲酸酰肼溶液和0.008mol/L氯化钙溶液在反应中都是过量的。
2.3.1 加热池改造：我们利用该套仪器氯检测通道不使用的加热池做为成脎反应加热池，将设定温度调至所需85℃。原有的加热池做为水解加热池，按新标准将设定温度调至95℃。
2.4.1 滤光片：将原仪器使用的460nm滤光片，按新标准换为410 nm滤光片。
3.结果与结论
3.1结果
改造后，我们按YC/T159——2002中4.11配制葡萄糖浓度为0.6g /L、1.2g /L、1.8 g/L 、2.4g/L 、3.0 g /L的5个工作标准溶液，依据YC/T159——2002中6 分析步骤 对仪器做了实验验证。
3.1.1准确度：用标准物质GBW08514（总糖标准值18.8%，不确定度0.8%）按仪器检测要求制样，做平行实验，所得结果如下（表1）：
表1. 方法的准确度实验结果
|
样品编号 |
检测值（%） |
绝对差 |
平均值（%） |
|
1 |
18.68 |
0.48 |
18.92 |
|
2 |
19.16 |
按国标YC/T159——2002要求检测结果修约为18.9%
3.1.2重复性
将五个样品按仪器检测要求制样，每个样品在仪器上检测五次，所得检测结果处理见表2：
表2. 方法的重复性实验结果（n=5）
|
样品编号 |
S1 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
|
检测值（%） |
19.92 |
22.05 |
24.70 |
26.86 |
25.14 |
|
19.88 |
21.67 |
24.48 |
26.70 |
24.94 |
|
|
19.90 |
21.77 |
24.57 |
26.73 |
25.22 |
|
|
19.86 |
21.77 |
24.72 |
26.80 |
25.00 |
|
|
19.67 |
21.82 |
24.61 |
26.79 |
25.20 |
|
|
最大绝对差% |
0.25 |
0.38 |
0.24 |
0.16 |
0.28 |
|
糖浓度平均值% |
19.85 |
21.82 |
24.62 |
26.78 |
25.10 |
|
标准差 |
0.101 |
0.142 |
0.098 |
0.063 |
0.124 |
|
变异系数 |
0.005 |
0.007 |
0.004 |
0.002 |
0.005 |
|
重复性（最大相对偏差%） |
0.91 |
1.05 |
0.57 |
0.30 |
0.64 |
|
最大相对偏差 平均值 |
0.69% |
||||
3.1.3方法的回收率实验
用3种不同的样品分别加入0.0452 g 的葡萄糖糖，经实验测得回收率结果如下（表3）。
表3. 方法回收率实验结果
|
样品含糖量（g） |
添加糖量（g） |
合计（g） |
检测值（g） |
回收率（%） |
|
0.0318 |
0.0452 |
0.0770 |
0.0753 |
97.79 |
|
0.1059 |
0.0452 |
0.1511 |
0.1574 |
104.2 |
|
0.1430 |
0.0452 |
0.1882 |
0.1900 |
101.0 |
3.2结论
从以上实验结果可以看出，准确性实验中标准物质检测结果在不确定度的范围内；重复性测试最大相对偏差为1.05%，变异系数最大为0.007；回收率为97.79%-----104.2%。改造后仪器性能良好。检测原理与反应条件满足行业标准要求。因此，这种改造是可行的。
参考文献
1.中华人民共和国烟草行业标准YC/T——2002《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》 国家烟草专卖局发布 中国标准出版社出版 2002
2.徐积功编 有机化学基础 高等教育出版社出版 1991
3.新亚铜法： 由仪器生产厂商法国ALLIANCE提供
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