RP-HPLC测定连翘病毒清胶囊中连翘酯苷和连翘苷的含量

目的：建立连翘病毒清胶囊中连翘酯苷和连翘苷的RP-HPLC含量测定方法。方法：采用YWG-Cl8色谱柱(4.6 mmx 250mm，10／an)；连翘苷含量测定流动相乙腈-水(25：75)，流速0.8mL/min，检测波长277nm；连翘酯苷含量测定流动相乙腈-水-冰醋酸(17：83：0.4)，流速1.0 mL/min，检测波长280nm。结果：连翘苷平均回收率为99.6％，RSD 1.9％(n=5)；连翘酯苷平均回收率为101.3％，RSD2.5％(n=5)。结论：所建立的方法简便、准确、可靠，可作为连翘病毒清胶囊的质量控制方法。
    [关键词]连翘病毒清胶囊；连翘苷；连翘酯苷；HPLC；含量测定
    连翘为中医常用的清热解毒药，历来被视为疮家要药。具有清热解毒，消肿散结功效，用于治疗风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神晕发斑，热淋尿闭尚有乳痈等病。作者对连翘进行了稀醇提取及大孔吸附树脂纯化等的工艺研究，结合活性筛选，确定了其抗流感病毒的有效部位，并在此基础上制备了连翘病毒清胶囊。为了有效控制连翘病毒清胶囊的内在质量，本研究建立了连翘病毒清胶囊中连翘苷和连翘酯苷的RP-HPLC含量测定方法，并对3批样品进行了含量测定。
    1 仪器与试药
    Waters515高效  液相色谱 仪；METTLER-AE240型电子分析天平(日本岛津)；CX-250型  超声波清洗 机(北京医疗设备二厂)；YWC-Cl8色谱柱(北京分析仪器厂制造)；乙腈为色谱纯；水为重蒸水；冰醋酸为分析纯。连翘苷对照品(批号0821-96O2)，购自中国药品生物制品检定所，连翘酯苷对照品自制，经紫外、红外、质谱、核磁共振及元
素分析确认结构，HPLC归一化法测定含量为98％以上。连翘购自北京同仁堂集团北城药材批发部，经北京中医药大学生药系刘春生副教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Tnunb．)Vah1．的干燥果实。
    2 方法与结果
    2．1 色谱条件
    2．1．1 连翘苷YWC-Cl8色谱柱(4.6mmX 250mm，10μm)，流动相乙腈-水(25：75)，流速0.8 mL/min，检测波长277nm，柱温为室温，理论塔板数以连翘苷峰计应不低于3500。
    2．1．2 连翘酯苷YWG—Cl8色谱柱(4.6mm×250mm，10μm)，流动相乙腈-水-冰醋酸(17：3：0.4)，流速1.0 mL/min，检测波长280nm，柱温为室温，理论塔板数以连翘酯苷峰计应不低于8000。
上述色谱条件下，连翘病毒清胶囊中连翘苷和连翘酯苷色谱峰分别与其他成分分离良好。
    2．2 对照品溶液的制备
    精密称取连翘苷和连翘酯苷对照品适量，分别加甲醇制成0.0820，0.0505g/L的对照品溶液。
    2．3 样品溶液的制备
    取连翘病毒清胶囊内容物各约25，10 mg，精密称定，分别加50％乙醇适量，超声波处理使之溶解后，定容至10 mL量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，作为测定连翘苷的样品溶液I和测定连翘酯苷的样品溶液Ⅱ。
    2．4 线性关系的考察
    分别精密吸取连翘苷对照品溶液2.5，5.0，10.0，15.0，20.0μL和连翘酯苷对照品溶液3.0，5.0，10.0，15.0，20.0μL，按上述连翘苷和连翘酯苷色谱条件，测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，计算回归方程。连翘苷：Y=806271X一1157.2，r=0.9998，线性范围0.21～1.6μg；连翘酯苷：Y=245399 +63339，r=0.9996，线性范围0.15～1.0μg。
    2．5 精密度试验
    精密吸取样品溶液I20.0μL和样品溶液Ⅱ5.0μL，分别连续进样5次，测得连翘苷色谱峰峰面积平均值为1013 553，RSD 0.78％，连翘酯苷色谱峰峰面积平均值为237 466，RSD 1.1％。
    2．6 稳定性试验
    精密吸取样品溶液I20.0μL和样品溶液Ⅱ5.0μL，分别在制备后0，4，8，12，24h和0，2，4，8，12，24h进样，测定连翘苷和连翘酯苷色谱峰峰面积，计算峰面积相对标准偏差RSD分别为1.7％和2.1％。表明样品溶液I和样品溶液Ⅱ在24h内稳定性均良好。
    2．7 回收率试验
    2．7．1 连翘苷回收率试验 精密称取已知含量(1.41％)的连翘病毒清胶囊内容物5份，每份约15.0mg，置10 mL量瓶中，分别精密加入含量为0.0820g/L连翘苷对照品溶液2.5mL，照样品溶液制备项下方法处理，按样品测定项下方法测定，计算平均回收率为99.6％，RSD 1.9％。
    2．7．2 连翘酯苷回收率试验精密称取已知含量(11.20％)的连翘病毒清胶囊内容物5份，每份约5.0 mg，置10mL量瓶中，分别精密加入含量为0.050 5g/L 连翘酯苷对照品溶液10.0 mL，照样品溶液制备项处理，按样品测定项测定，计算平均回收率为101.3％，RSD 2.5％。
    2．8 重复性试验
    分别取同一批连翘病毒清胶囊，按样品测定项下方法，各连续测定5次，得连翘苷平均含量为1.41％，RSD 1.4％(n=5)；连翘酯苷平均含量为11.2％，RSD 2.9％(n=5)。
    2．9 样品测定
    分别精密称取3批连翘病毒清胶囊内容物，按样品溶液的制备项下方法分别制备样品溶液；精密吸取样品溶液I 20.0μL，样品溶液Ⅱ5.0μL，连翘苷对照品溶液8.0，10.0μL，连翘酯苷对照品溶液5.0，10.0μL，注入  液相色谱 仪，依法测定，计算连翘苷和连翘酯苷的含量。
    3 讨论
    3．1 连翘酯苷为本室自制，采用聚酰胺加压柱色谱法进行初步分离，可有效地与其他成分分开，再用葡聚糖凝胶柱纯化，用甲醇及水系统洗脱，可得到良好晶形的连翘酯苷。连翘酯苷很不稳定，在制备过程中，条件偏酸或偏碱以及温度过高，都易引起分解。使用时，溶液配制后应立即用黑纸包裹，放于冰箱内储存，以免分解。
    3．2 在连翘成分分析方面前人已打下坚实的基础，本研究在此基础上所建立的连翘苷的分析方法，样品预处理简便，也同样适用于连翘药材中连翘苷含量的测定；在连翘酯苷的HPLC分析过程中，加入少量冰醋酸，连翘酯苷的峰形得到很好的改善，测定时使用YWG-Cl8柱，采用乙腈-水-冰醋酸为流动相，具有广泛的实用价值。
    3．3 本研究采用高效  液相色谱 方法，选用连翘酯苷和连翘苷作为指标性成分，对连翘病毒清胶囊中有效成分进行含量测定，并分别对精密度、稳定性、重现性和回收率进行了考察。实验结果表明所建立的方法稳定、准确、可靠，能有效控制连翘病毒清胶囊的内在质量，为该制剂的进一步研究开发奠定了基础。