LC-MS/MS检测食品基质中三聚氰胺和三聚氰酸
引言：
2007年3月，北美几个宠物食品生产厂家自发的在全国发起产品回收的公告，这一举动源于报道其产品中有一些会引起宠物肾衰竭的物质成分【1】，用于生产宠物食品的源材料是从中国进口的小麦麸，已经被认定是污染的源头【2】。虽然，早期报道表明这种污染物在宠物食品中是被禁用的。但是,进一步调查研究发现污染有三聚氰胺的饲料已经被用于人所食用的动物喂养【3、4、5】。特别是，它已经存在于鸡、猪、鲶鱼的饲料中。因此，美国FDA和USDA开发了动物器官中三聚氰胺残留检测方法―――强离子交换固相萃取的液湘色谱－串联质谱检测。
药品和试剂：
除了特别说明的试剂而外，所有使用的有机溶剂均为色谱纯，并购自Thermo Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)。三聚氰胺、三聚氰酸和30％（w/w）氨水购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。所使用的内标是13C3标记的三聚氰胺和三聚氰酸，由13C3氯化氢标记，也购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。Milli-Q™超纯水系统提供了18 MΩ的实验用水，Milli-Q™超纯水系统购自Millipore (Billerica, MA, US)。
标准溶液制备：
先用50% (v/v)甲醇水分别配制1000 µg/mL的三聚氰酸、三聚氰胺溶液。分别取1mL上述溶液，用1:3的水-乙晴进行稀释，获得终浓度为10 µg/mL的储存标准溶液。另外，分别取10 µg/mL的储存标准溶液1mL，用乙晴进行连续稀释，获得1-1000 ng/mL范围内的8个标准工作溶液。取50 µL内标储存标准溶液分别加入到1mL上述 8个标准工作溶液中，即为校正标准溶液。
样品制备：
固体样品放在Ultra-Turrax® (IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany)中高速搅拌成均匀微粒。然后加入1:1水－甲醇抽提，取水相。加入内标准品。样品制备由非在线离子交换色谱SPE小柱完成。
液湘色谱：
仪器：BioBasic™AX (Thermo Fisher Scientific, Bellefonte, PA)。液湘色谱柱：粒径5μm、内径2.1 mm、长150 mm，分析柱温：30°C。最初流动相为乙晴－异丙醇－50 mM醋酸铵，其各组份比率为85:10:5，流速为400 μL/min。五分钟以后，流动相立即改变为9:1的水－乙晴，流速转换为500 µL/min，平衡5min。流动相再变回到最初的流动相，流速也换回到400 µL/min。在最初的1.5min里，柱子另一端的流出液接入废液，随后接在检测器上，即运行保留时间。
质谱条件－三聚氰胺
质谱：TSQ Quantum Ultra 系列质谱仪（Thermo Scientific）
源极：加热电喷雾离子源(H-ESI)
离子化：正离子电喷雾离子源
夹套气压(N2)：65 units
辅助气压(N2)：35 units（250°C）
离子转换管温度：350°C
扫描时间：200 ms/transition
Q1/Q3 分辨率: 0.7 FWHM
SRM变调：
13C3标记的三聚氰胺 三聚氰胺（内标）
m/z 127 68 @ 32 eV m/z 130 70 @ 32 eV
m/z 127 85 @ 18 eV m/z 130 87 @ 18 eV
QED-MS/MS 条件：
碰撞能量：30 eV
反向碰撞能量（RER）：50 eV
质谱条件－三聚氰酸
质谱：TSQ Quantum Ultra 系列质谱仪（Thermo Scientific）
源极：加热电喷雾离子源(H-ESI)
离子化：负离子电喷雾离子源
夹套气压(N2)：75 units
辅助气压(N2)：10 units（250°C）
离子转换管温度：350°C
扫描时间：200 ms/transition
Q1/Q3 分辨率: 0.7 FWHM
SRM变调：
13C3标记的三聚氰酸 三聚氰酸（内标）
m/z 128 42 @ 17 eV m/z 131 43 @ 17 eV
m/z 128 85 @ 11 eV m/z 131 87 @ 11 eV
结果：
图1是三聚氰胺、三聚氰酸、13C3标记的三聚氰胺和三聚氰酸的标准色谱图。图2、3分别为三聚氰胺、三聚氰酸浓度范围为1-1000 ppb的标准曲线，该标准曲线在整个浓度范围内具有较好的线性关系。同时，在图中也给出了该曲线中1-100 ppb区段的放大图。从图4可以看出，在鲶鱼基质样品（具体样品制备方法见前面所述）谱图中有三聚氰胺、三聚氰酸相应的尖峰，其分别为10 ppb、50 ppb。而且其他杂峰也表现较弱。可见，该样品制备方法对摒弃杂质具有较好的效果。 另外，通过使用QED-MS/MS扫描功能收集到全波长数据，QED-MS/MS是通过监测SRM数据而工作的。即当一个特殊的SRM反应达到阈值水平时，MS/MS全扫描功能就被激活。图5 给出了100 ppb三聚氰胺和其内标的全波长扫描结果。全波长扫描数据在谱库中进行搜寻，从而对谱图结果进行确认，并消除假阳性。当10 ppb鲶鱼样品QED-MS/MS全扫描谱图尖峰在谱库中进行搜寻时，谱库给出最匹配结果为三聚氰胺（见图6）。图6的左下四分之一处是样品的谱图和谱库给出的匹配标准谱图，上面为样品谱图，下面为谱库给出的匹配标准谱图。从图上可以看出，即使提供的匹配标准谱图是使用没有基质的标准品产生的，但这两者之间仍然有很好的匹配度。
图1：1 ppb的三聚氰胺、三聚氰酸和其内标物――13C3标记的三聚氰胺和三聚氰酸的色谱图（由上至下依次为：三聚氰酸、13C3标记的三聚氰酸、三聚氰胺、13C3标记的三聚氰胺）
图2： 三聚氰胺的标准曲线（浓度范围为1-1000 ng/mL），其中，左图给出的是1-1000 ng/mL完整范围内的标准曲线，右图则是左图中10-100 ng/mL区段的放大。
图3：三聚氰酸的标准曲线（浓度范围为1-1000 ng/mL），其中，左图给出的是1-1000 ng/mL完整范围内的标准曲线，右图则是左图中10-100 ng/mL区段的放大。
图4：鲶鱼基质中三聚氰酸、三聚氰胺分析检测色谱图，其含量分别为50 ppb、10 ppb 。
图5：左图为13C3标记的三聚氰胺QED-MS/MS谱图，右图为三聚氰胺QED-MS/MS谱图
图6：10 ppb鲶鱼基质谱图对照谱库的搜寻结果，图上可以看出三聚氰胺跟其匹配率最高。
结论：
一种专门用来对食物中三聚氰胺、三聚氰酸进行检测并定量的方法已经被证实，而且该方法是操作简单、灵敏度好。该方法可以用来对很多样品进行分析，分析柱的性能也不会因此而退化。另外，QED-MS/MS也具有Q3全范围扫描功能，它允许结果在谱库中进行结果查找，从而避免了假阳性。
参考文献：
1、 Weis, E. Nestlé Purina, Hills join pet food recall.
http://www.usatoday.com/news/nation/2007-03-31-pet-food-recall_N.htm.
Accessed 10 December 2007.
2、 Aarthi Sivaraman. Melamine in pet food, wheat gluten from
http://www.reuters.com/article/domesticNews/idUSWEN594320070330.
Accessed 10 December 2007.
3、 Weise, E. and Schmit, J. Melamine in pet food may not be
accidental.
www.usatoday.com/money/industries/2007-04-24-fda-pet-food-probe_N.htm.
4、 Fish on U.S. fish farms fed melamine-contaminated feed;
FDA discovers contaminated food products from
American Veterinary Medical Association. Available at
www.avma.org/press/releases/070508_petfoodrecall.asp.
Accessed 10 December 2007.
5 、Melamine contaminant found in chicken feed. Available at
www.sciencedaily.com/releases/2007/05/070502072434.htm.
Accessed 10 December 2007.
关注本网官方微信 随时阅权威资讯
