可用于LC-MS的三聚氰胺非离子对检测新方法
冯薇1,王伯初1* ,米鹏程1 , 雷宇2，周提军2，杜慧娟1，王兵2
(1．重庆大学生物工程学院，重庆400044)
(2．北京泰克美科技有限公司，北京100070)
0 引言
三聚氰胺（melamine）简称三胺，学名三氨三嗪，别名密胺、氰尿酰胺、三聚酰胺[1]。作为一种重要的化工原料，主要用于生产塑料、胶水和阻燃剂[2]。三聚氰胺含氮量为66.6％，折合成粗蛋白含量为416.27%，加入宠物饲料中可以大幅了提高蛋白质测定表观含量，但动物食用后可诱发肾衰竭并导致死亡，因此一直禁止在饲料中使用[3]。近期，国内外发生多起宠物因食用添加了三聚氰胺的宠物食品而致死的例子，大量相关产品被召回。
目前对于三聚氰胺除了常规的电位滴定法等理化检测手段，主要使用GC—MS检测。在液相色谱中，由于该化合物含有三个有机氮基团，极性强，其溶解性质决定了其不可能使用正相色谱柱进行分离，而在普通C18反相柱上则难以保留，洗脱过快，无法达到分离效果。文献报导的HPLC方法基本都须加入庚烷磺酸钠一类的离子对试剂以增加三聚氰胺的保持[4-7]，此种方法虽然能够分离定量，但限制了LC—MS的应用。
本文采用新型的SCX—C18混合填料色谱柱测定三聚氰胺，该柱内填充的是均匀混合的SCX和普通C18粒子，兼具离子交换和反相分离的特点，检测中不需加入离子对试剂，可应用与LC-MS联机，操作简便、灵敏度高。
1 实验及方法
1.1仪器、试剂与材料
本实验使用SHISEIDO SI-2高效液相色谱仪系统（日本，SHISEIDO公司），含在线真空脱气机（D3010）, 自动控制恒温柱温箱（3004），双泵（D3001）及自动进样器（D3023）及紫外检测器（D3002）。
电子天平为ACCULAB ALC—110.4（德国，赛多利斯公司）。所有玻璃仪器均为博美（BOMEX，北京玻璃仪器厂）出品。
三聚氰胺标准品（色谱纯度≥99.9％，美国ACROS公司出品，购自北京艾杰尔科技有限公司）；乙腈（J&K，北京百灵威公司）；超纯水在本实验室制备而得。
1.2 色谱分离条件
本实验所用色谱柱为CAPCELL PAK CR 2.0×
流动相配制如下：首先配制10mmol/L 醋酸铵溶液750mL，与750mL乙腈充分混合， 再用醋酸调节混合液的pH值至pH=3.0，最后用0.45μm的滤膜过滤后备用。
2 实验过程与结果
三聚氰胺标准贮备液（1mg/mL）：准确称量100.6mg三聚氰胺标准品于100mL容量瓶中，用流动相溶解并准确定容至刻度，并用0.45μm的滤膜过滤，备用。
2.1 保留时间与峰形
图1为本方法检测三聚氰胺的图谱（样品浓度为0.025mg/mL）
图1 三聚氰胺图谱
由图1可见，本方法所测三聚氰胺保留时间约为4.93min，峰形尖锐，对称性好。
2.2 精密度
分别移取10mL和2mL三聚氰胺标准贮备液于100mL容量瓶中，用流动相稀释并准确定容至刻度。分别连续进样6次，结果如表1所示。
表1 保留时间与峰面积的稳定性对比（方法精密度验证）
由表1结果可见，本方法测定三聚氰胺精具有很好的精密度和重现性。
2.3 线性关系
移取5mL贮备液于100mL容量瓶，用流动相稀释并准确定容至刻度，得到浓度为0.0503mg/mL的三聚氰胺溶液（a）。分别移取25mL、20mL、15mL、10mL、5mL溶液a于50mL容量瓶，用流动相稀释定容，得到浓度分别为25.15μg/mL、20.12μg/mL、15.09μg/mL、10.06μg/mL、5.03μg/mL的溶液（b、c、d、e、f）。进样结果如表2所示。
由此结果计算得回归方程y = 8E+07x - 3499.5，相关系数R2 = 0.9997（见图2），线性良好。
图2 浓度与峰面积的回归曲线
2.4 回收率
分别移取0.8mL、1.8mL、2.2mL贮备液于100mL容量瓶中，用流动相稀释定容，得到浓度分别为8.048μg/mL、18.108μg/mL、22.132μg/mL的样品溶液。进样并用曲线进行计算，所得结果对比如表3所示。
2.5 检测限
移取0.01mL贮备液于100mL容量瓶中，用流动相稀释定容，得到浓度为0.1μg/mL的样品溶液。按10μl、5μl、4μl……依次进样，测得本方法检测三聚氰胺的检出限为0.032μg/mL（按信噪比3：1计算）。
3 结论
通过上述实验和讨论可见，运用本方法测定三聚氰胺，可将其保留时间延长到4.9min左右，峰型良好，对称度高。该方法无需在流动相中加入离子对试剂，适于液质联机(LC—MS)。此外，还具有操作简单方便，灵敏度高和准确度高等优点，适用于农业检验、检疫、生产等实践过程。
本方法提示出，使用SCX-C18混合填料柱，可在不含离子对试剂的简单流动相下对强极性物质进行良好分离，并且适宜LC-MS联机使用，应用前景广阔。
参考文献
[1] http://www.cfsan.fda.gov/-dms/melamra.html
[2] 王会串.三聚氰胺的生产技术和应用前景[J].精细与专用化学品,2007,15(11):33～36.
[3] 侯艳丽,张惠茹,刘来亭,兰尊海.三聚氰胺的检测方法[J].河南畜牧兽医,2007,28(9):32～33.
[4] 俞建君,吴芳珍.反相离子对色谱法测定工业三聚氰胺含量[J].广东化工,2007,34(171):126～127.
[5] 辜雪英,吴小花,仇满珍.饲料中三聚氰胺残留量高效液相色谱测定的研究[J].江西化工,2007,2:70～73.
[6] FDA.GC-MS Screen for Presence of Melamine. Adapted from FDA/ORA Forensic
[7]
A Novel Non-ion-agent Chromatographic Analysis Method of Melamine for LC-MS
Wei FENG1,Bochu WANG1* ,Pengcheng MI1 , Yu LEI2，Tijun ZHOU2，Huijuan DU1，Bing WANG2，
(1.College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China；2.Techmate Co.,Ltd.,
Abstract: A novel chromatographic method of melamine, suitable for LC-MS, is built in this paper. Without any ion-pair agent, a SCX-C18 mixture filled RP-HPLC column was used. The eluent was
Keywords: Melamine; SCX-C18 mixture filled column (CR); Liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS)
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