摘要：[目的]精确测定咖啡因在饮料中的含量，建立测定饮料中咖啡因含量的RP-HPLC法的最佳工作条件。[方法]色谱柱为Waters Symmetry RP18；150×3.9mm(5μm)；流动相为A为0.02M乙酸铵，B为甲醇；流速为0.7ml／min；DAD检测波长207nm。[结果]本法操作简便、准确、线性关系良好，相对标准偏差小于1%，加标回收率为9O.1%～ 101.0%。 [结论]与现行国标方法相比，通过优化了的色谱条件，节省了贵重的有机溶剂，提高了测定灵敏度及检出范围。
关键词：RP-HPLC法；饮料；咖啡因
咖啡因又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1，3，7-三甲基黄瞟呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。为此，到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中。本文利用反相高效液相色谱法实现了饮料中咖啡因的测定，并对检出限和定量限、标准曲线、方法的准确度和精密度作了验证。
1 材料与方法
1．1 仪器 美国Waters Alliance 2695高效液相色谱系统(带有自动进样器、四元梯度泵)；Waters 2996二极管阵列检测器(DAD)和Empower色谱信息管理系统；KQ-250B型超声波清洗器。
1．2 试剂 甲醇(色谱纯)，乙酸铵(分析纯)，实验用水为超纯水，咖啡因标准品(公安部物证鉴定中心)。以上试剂均需经0.45μm滤膜过滤后使用。
1．3 色谱条件 色谱柱Waters Symmetry RP18：150mm×3.9mm(5μm)；检测波长207nm；流动相A为0.02mol／L乙酸铵溶液，B为甲醇，A：B=8O：2O；流速0.7ml／min；进样量1Oμl，柱温为室温。
1．4 样品制备
1．4．1 样品选择 济南市市售可乐型饮料2O份。
1．4．2 样品处理 样品在4O℃ 超声10min，取脱气试样10ml经稀释定容至100ml。
2 结果
2．1 波长与流动相配比选择 应用二极管阵列检测器对所测物质进行光谱扫描，发现被测物质在206.4、273.5 nm处有两个依次降低的吸收峰，因此确定检测波长为207nm。采用有机相(B)35%、30%、25%、2O%4种比例进行实验。结果表明有机相体积分数为20％时，结果令人满意。
2．2 咖啡因的检出限和定量限 将咖啡因标准品浓度以3倍信噪比浓度为起点，用流动相稀释至0.024、0.10μg／ml，分别重复进样6次。按1．4．2处理样品，在样品中的最低检出浓度为0.024μg／ml.
2．3 方法的线性范围 配制成咖啡因浓度为0、10、25、50、100、200、250μg／ml的标准系列，单一浓度按
上述方法测定6次，根据测得数据计算相对标准偏差(RSD)，RSD小于1%。标准曲线以质量浓度(X，μg／m1)为横坐标，相应的峰面积(Y×1000000)为纵坐标进行线性回归，回归方程为Y=0.1724X一0.010 17，相关系数r=0.999 7，咖啡因浓度范围在0～250μg／ml线性很好。
2．4 方法的精密度试验 选择3份含低、中、高不同含量被测组分的样品，分别平行测定5次.
2．5 方法的准确度试验 在已知本底的样品中，分别加人低(25μg／m1)、中(100 Vg／m1)、高(250 Vg／m1)
三种质量浓度的咖啡因，按照实验条件和步骤测定其
回收率。
2．6 比较实验 用本法与国标法同时测定20份饮料中咖啡因含量，对结果进行配对t检验(t=0.5755<
t0.05(19)=2.093，P>O.05)，两法差异无统计学意义。
3 小结
本方法适用于饮料中咖啡因的测定，操作简便，灵敏度高。经验证，加标回收率为9O.1～101.0%，最低
检出限为0.24μg／ml，最低定量限为1.0μg／ml，线性范围为0～250μg／ml，相关系数为0.9997。
参考文献：
[1]黄百芬．铁晓威，任一平．高效液相色谱法测定冰茶栓中的咖啡因[J]．中国卫生检验杂志，2004，14(1)：61．
