RP-HPLC法测定炎可宁片中黄芩苷的含量研究

　摘要：目的：建立一种可测定炎可宁糖衣片中黄苓苷含量的RP-HPLC方法。方法：采用Shim-packVP-ODS(150mm×4.6mm 5μm)为色谱柱；流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液(22：78)；检测波长为278nm；流速为1.0mL／min；峰面积外标法定量；结果：黄苓苷在40.2μg/mL～321.5μg/mL范围内呈良好的线性关系，(r=0.9999)平均回收率分别为99.14％；RSD1.91％；结论：方法简便，快速，准确可靠，可作为该制剂的质控方法。
关键词：高效液相色谱法；炎可宁糖衣片；黄苓苷；含量测定
    炎可宁糖衣片，为现代中药复方制剂。采用高效液相色谱法测定黄芩苷的含量。结果准确。操作方便，可用于该制剂的质量控制。经方法学研究。证明本法可行。
    现报道如下。
    1 仪器与试药
    日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪。自动进样系统；CLASS-VP ver．6．1色谱数据工作站．BOLONGUSC-302超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)。日本岛津UV-2450型紫外分光光度计。乙腈为色谱纯；磷酸(分析纯)；水为重蒸馏水；黄芩苷对照品由中国药品生物制品检定所提供．批号：0753—9910，(供含量测定用)经HPLC归一化法测定色谱纯度为99.8％。炎可宁糖衣片(市售批号：030508 040328 020329 040417)。
    2 色谱条件
    色谱柱：Shim-paek VP-ODS(200mm ×4.6mm 5μm)；流动相；乙腈-0.1％磷酸溶液(22：78)；检测波长为278nm；流速：1.0mL／min；柱温：30℃；进样量：10μl；面积外标法定量。
    3 方法与结果
    3．1 供试品溶液的制备
    样品溶液的制备 取炎可宁糖衣片10片。去除糖衣，碾细，精密称取细粉约0.5g，置具塞三角瓶内，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取20min。放冷，称定重量．再用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，作为样品溶液。
    阴性空白对照溶液的制备 按其质量标准中的处方比例，制备缺味(黄芩)中药的阴性空白样品，照上述样品溶液的制备方法制成阴性空白对照溶液。
    对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品40mg．置100mL量瓶中，用70％甲醇超声溶解并稀释至刻度。摇匀，精密吸取5mL置10mL量瓶中．加入70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每mL含黄芩苷0.2mg的对照品溶液。
    3．2 系统适用性试验取黄芩苷对照品溶液、阴性空白对照溶液和样品溶液，按上述色谱条件下进样10μL，测绘HPLC图谱。由图谱可知，阴性空白对照溶液在黄芩苷对照品出峰时间区域没有干扰峰出现，故样品对黄芩苷的测定无干扰作用。理论板数按黄芩苷峰计算不应低于3000。分离度大于1.5，黄芩苷对称因子为0.95～1.05之间。
    3．3 线性关系的考察
    精密称取黄芩苷对照品约50.23mg，置50mL量瓶中，用70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为黄芩名：对照品储备液。精密吸取储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0mL分别置25mL量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，分别进样10μl，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、黄芩苷进样量(X)为横坐标进行线性回
归。得回归方程。
    回归方程：黄芩苷Y=3442176X+141794 r=0.9999
    结果表明，黄芩苷的溶液在40.2μg/mL～321.5μg/mL 之间呈良好的线性关系。
    3.4 精密度试验 取同一批供试品溶液，进样10μl，重复进样5次，结果黄芩苷峰面积基本不变。黄芩苷RSD为0.86％，再取同一批黄芩苷对照品溶液，重复进样5次，结果黄芩苷峰面积也基本不变，黄芩苷RSD为0.51％，说明仪器性能良好。
    3.5 重复性试验 取同一批号样品6份(批号：040328)，按1．1项下操作平行测定5次，结果黄芩苷的含量为0.1354mg／mL，RSD为1.71％(n=6)。说明方法重现性良好。
    3．6 稳定性试验取同一批号样品溶液(批号：030508。每克含黄芩苷7.315mg)，在常温下放置12h，每间隔2h测定1次，连续共测定6次，结果黄芩苷峰面积RSD为1.56％。表明样品溶液的稳定性良好。
    3．7 回收率试验采用加样回收法，精密吸取已知样品含量(批号：030508，每g含黄芩苷7.315mg)的溶液lmL置10mL量瓶中，再分别加入上述黄芩苷对照品储备液1.0、2.0、3.0mL的黄芩苷混合对照品溶液(每一浓度3份：低、中、高)，再用70％甲醇溶液稀释至刻度。混匀。分别进样，测定峰面积，计算结果。
    3．8 样品的含量测定 取炎可宁片1O片，去除糖衣，碾细．精密称取细粉约0.5g．置具塞三角瓶内，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取20min，放冷，称定重量，再用7O％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，作为样品溶液。另精密称取黄芩苷对照品适量，同3．1项下制备对照品溶液，按上述色谱条件进样10μl，记录黄芩苷峰面积，按外标法计算含量。
    4 讨论
    4．1 检测波长的选择取上述黄芩苷对照品溶液，用日本岛津UV-2450紫外分光光度计在波长200nm～400nm处扫描，结果在278nm波长处有最大吸收。故以278nm为检测波长。
    4．2 样品的提取 笔者曾用70％甲醇，分别超声提取5、10、20、30min后进样测定峰面积比较，结果超声处理20min以后黄芩苷峰面积基本不变，均能使样品全部溶解。故超声处理20min即可。
    4．3 柱温的选择柱温虽对组分的分离度影响较小，但对样品组分的(t g)值影响较大，经反复试验：柱温在30℃时既可加快分析速度，又可保持出峰时间的恒定，从而保证试验结果的重复性和准确性。
    4．4 流动相的确定 笔者对流动相中乙腈与不同浓度的磷酸溶液配比对峰形的影响进了考察。实验结果表明，随磷酸浓度的增加，峰形进一步变尖锐。但考虑到酸度对色谱柱的影响(要求流动相PH应大于2.0)，当流动相配比为乙腈一0.1％磷酸溶液(22：78)时黄芩苷峰与杂质峰分离较好，同样具有较好的峰形。此时流动相的PH为2.5左右。
黄芩苷为炎可宁糖衣片中的主要活性成分，具有消炎镇痛的作用，故应以方中的黄芩(黄芩苷)作为控制该制剂质量的主要指标依据。本文采用适当的提取分离方法，建立了反相高效液相色谱法测定炎可宁糖衣片中黄芩苷的含量，获得了满意的结果。