高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中6种玉米赤霉醇类药物残留

　      玉米赤霉醇（zeranol，ZER），属于雷索酸内酯类非甾体同化激素。ZER作为牛羊促生长剂，以耳根埋植的形式应用，促进蛋白质的合成，能提高胴体瘦肉率及饲料转化率。但是，玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，在动物尿液中的残留会引起人体性机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，还可能致癌。ZER排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染。1998年欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖，我国农业部第235号公告明确规定玉米赤霉醇禁用于所有食品动物，所有可食动物尿液不得检出。由于玉米赤霉醇作为牛羊增重剂效果好，经济回报高，仍有违法使用的现象。

      目前国际上动物性食品中玉米赤霉醇残留仪器检测方法主要有液－质联用法和气－质联法法。本文建立了猪、牛、羊及鸡肌肉和肝脏、牛奶和鸡蛋等动物源性食品中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮等6种玉米赤霉醇类药物的液相色谱-串联质谱测定方法。

1. 实验部分

1.1 仪器与试剂

      TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪（赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司），配置有电喷雾电离源（ESI）；Surveyor MS Pump液相色谱系统，包括Surveyor AS自动进样器。
标准品α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮纯度均大于97 ％。用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC色谱纯。

1.2 样品制备

1.2.1 取样
      称取约500 g动物肌肉、肝脏，完全切碎后，匀浆备用；取10枚鲜蛋，去壳，均质备用；取鲜牛奶500 mL，混匀备用

1.2.2 提取
      试样5 g，置于50 mL离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋混合1 min，离心10 min（5000 r/min），取上清液转移至另一离心管中。重复提取一次，合并两次提取液并移取15 mL于另一离心管中，氮气流下吹至小于1 mL（50 ℃），用3 mL 0.1 mol/L NaOH调节pH＝11.0，离心5 min（5000 r/min），待净化。

1.2.3 净化
      用MCX固相萃取柱进行SPE净化。依次用甲醇、水各2 mL活化固相萃取柱后，上样，抽干，然后用5 ％甲酸甲醇溶液3 mL洗脱。收集洗脱液，洗脱液在下 N2流下吹干（50 ℃），残渣以20 ％乙腈水溶液1.0 mL溶解，过0.45 μm滤膜，供LC/MS/MS法测定。

1.3 液相色谱及质谱条件

1.3.1 色谱条件
色谱柱：Thermo Hypersil Gold (150 × 2.1 mm,5 μm)；梯度洗脱见表1，其中A：水（0.1%甲酸）；B：乙腈；流速：250 μL/min；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

Time(min)	A(%)	B(%)
0	70	30
5	70	30
8	10	90
12	10	90
12.1	70	30
14	70	30

1.3.2 质谱条件
      电喷雾电离源（ESI），负离子模式；选择反应监控（SRM）扫描模式，喷雾电压：3500 V；离子传输管温度：350 ℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为40 arb, 辅助气为8玉米赤霉烯酮 arb，氩气用作碰撞气, 碰撞压力为1.5 mTorr; 选择反应监测（SRM）离子对见表2。

表2. 6种玉米赤霉醇类药物的SRM质谱条件

	药物名称	母离子	碎片离子（碰撞能量 V）
1	α-玉米赤霉醇	321	277（24），303（24）
2	β-玉米赤霉醇	321	277（24），303（24）
3	α-玉米赤霉烯醇	319	205（22），275（24），301（26）
4	β-玉米赤霉烯醇	319	205（22），275（24），301（26）
5	玉米赤霉酮	319	205（22），275（24），301（26）
6	玉米赤霉烯酮	317	175（26），273（20）

注：下划线碎片离子为定量离子

2 结果与讨论

2．1  方法灵敏度  （定量限，LOQ）：

      本方法在猪、牛、羊及鸡肌肉和肝脏、牛奶和鸡蛋等动物源性食品中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、 β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的检测限均可达到0.1 μg/kg，本方法在各肌肉组织、鸡蛋、牛奶中的α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的定量限为1.0  μg/kg。图2为得到的典型LC/MS/MS色谱图。

1. 玉米赤霉烯酮，2. α-玉米赤霉烯醇，3. β-玉米赤霉烯醇，4. 玉米赤霉酮，5. α-玉米赤霉醇，6. β-玉米赤霉醇

2.2 方法准确度：

      本方法玉米赤霉醇类药物在猪、牛、羊及鸡肌肉和肝脏、牛奶和鸡蛋等动物源性食品中的提取回收率均可达65 ～ 115 %。

3 结论

      本方法建立了玉米赤霉醇类药物在猪、牛、羊及鸡肌肉和肝脏、牛奶和鸡蛋等动物源性食品中的LC/MS/MS检测方法，其基本原理为：样品中的玉米赤霉醇类药物经乙腈提取，提取液在碱性条件下经MCX固相萃取柱净化后，高效液相色谱－串联质谱（LC/MS/MS）法检测。方法灵敏度、提取回收率、重现性等均满足国内外监控和检测要求。