荧光光度法测定榕树叶总黄酮含量的研究
黄酮类(flavontes)化合物是植物光合作用产生的一大类天然产物，已知的此类化合物约有2000多种，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成 分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。天然来源的生物黄酮分子量 小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、 抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰 老、抗辐射等作用［1~5］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。
榕树(Banyan)，是桑科榕属无花果类植物，全世界有800多种，主要分布在热带亚热带地区。我国榕属植物约100种，是热带雨林中的关键种类。榕 树叶，性凉，主治感冒、风热、肠炎、痢疾、百日咳、咽喉肿痛、湿疹、痔疮及麻疹不透［6］。研究表明［7］，黄酮类化合物是榕树叶的主要有效成分之一，具 有多种生物活性。榕树叶含三萜苷、黄酮苷、酸性树脂、鞣质、多酚类等，其中黄酮类和内酯类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消 除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品。目前对银杏类黄酮的研究较多，但对于榕树叶黄酮类化合物的研究还相 对缺乏［7］。
近年来，有关榕树叶总黄酮含量的检测采用紫外分光光度(UV)法［7］，紫外分光光度(UV)法的实验原理是根据 黄酮类物质与铝离子形成稳定的络合物，并产生特征吸收光谱而进行测定。该方法虽然操作简便，成本低，但是，由于榕树叶中成分复杂，富含多种酚类物质，对吸 光值产生干扰，影响实验结果的准确性［8］。因此，为了寻求操作简便、成本低、更加准确的检测方法，本文根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合 物，提出采用荧光光度法测定总黄酮的含量。
1材料与设备
960MC型荧光光度计(上海精密科学仪器有限 公司)，SHBIII型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，FA1104型电子天平(上海天平仪器厂)，索氏提取器，芦丁对照品(中国生物制 品检定所)，榕树叶(小叶榕)，200505采自右江民族医学院附属医院院内，经100℃烘干12h，粉碎，备用；其他试剂均为分析纯。
2原理和方法
2.1原理
紫外分光光度(UV)法的原理是根据黄酮类物质与铝离子形成稳定的络合物，并产生特征吸收光谱而进行测定。由于榕树叶中天然成分复杂，含有多种酚类化合 物，可与铝离子发生络合反应，形成干扰,使测定结果偏高。为此，本文根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合物，提出采用荧光分析法测定榕树叶总黄 酮含量，并进行干扰实验及回收实验证明实验原理。
2.2方法
2.2.1样品溶液的制备
精密称取榕树叶样品0.5000g，置索氏提取器中，适量石油醚加热回流30min，弃去石油醚提取液，并于温水浴中挥干残留的石油醚。然后加 50ml60%的乙醇加热回流提取1h，过滤，用60%乙醇定容至100ml。吸取样品溶液0.5ml，置于10ml容量瓶中,加入5%的AlCl3溶液 3ml，pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，用60%的乙醇定容，摇匀。
2.2.2芦丁对照品溶液的准备
精密称取芦丁对照品10mg，用60%的乙醇溶解，定容为100ml，即配成浓度为100μg?ml1的对照溶液。准确吸取对照溶液 0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml分别置于10ml容量瓶中，加入5%的AlCl3溶液3ml，pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，用 60%的乙醇定容，摇匀，即配成芦丁对照品溶液。
2.3测定在波长λ=460nm条件下［9］，测定芦丁对照工作溶液的荧光强度，以荧光强度对相应的浓度作图，绘制工作曲线，然后在相同的条件下测定样品中总黄酮的荧光强度，再用回归方程求出含量。
3结果
3.1测定条件的选择
3.1.1三氯化铝的加入量
黄酮类化合物与铝离子可生成稳定的荧光络合物，本实验考察了AlCl3的用量。实验表明，用5%的AlCl3溶液加入1~3ml为宜，本实验选择AlCl3的加入量为3ml。
3.1.2pH值的影响
溶液的pH值影响络合物的形成和荧光强度。在实验中发现，当溶液呈酸性pH为4~6时，溶液荧光强度最大，所以，实验中选择加入pH为4的醋酸醋酸钠缓冲液1ml。
3.1.3溶剂的影响
醇溶剂是黄酮类化合物最常用的提取溶剂,实验考察了不同浓度的乙醇溶液对荧光强度的影响。实验结果表明，当乙醇浓度达到60%以上,溶液荧光强度变化较小,考虑到成本因素,我们选用60%的乙醇作溶剂。
3.1.4静置时间的影响
将溶液静置于室内避免阳光直射并控制不同时间测定芦丁对照品溶液的荧光强度。实验结果表明，溶液荧光强度在50min内略有增加,然后有平缓下降趋势。所以,选择静置50min为最佳测定时间。
3.1.5干扰实验
实验了常见的金属离子对测定的干扰。结果表明，加入100倍的K ，Ca2 ，Mg2 对黄酮的测定无影响，但100倍的Fe3 对测定的干扰很大。
3.2工作曲线
实验表明，在0~20μg?ml1范围内有良好的线性关系,其线性回归方程为Y=0.4500X 17.5333，式中:Y表示荧光强度，x表示芦丁的浓度(μg?ml1)。相关系数r=0.9976,说明荧光强度与相应的浓度线性显著相关。
3.3样品测定及回收率实验
按实验方法测定了榕树叶总黄酮的含量,并对样品溶液进行平行测定(n=5)。结果见表1。表1榕树叶中总黄酮含量及精密度测定含量(略)
为了验证实验的准确性，在样品溶液中加入芦丁对照品进行回收实验，并计算回收率，结果见表2。由表2可知，荧光分析法测定榕树叶中总黄酮含量的平均回收率在99.8%~100.3%之间,实验结果准确可靠，说明本方法可行。表2样品回收率实验结果(略)
4结论
4.1实验结果表明，荧光光度法测定榕树叶总黄酮的含量,方法灵敏度高,其准确性、重现性、线性关系、稳定性都很好，能达到科研和生产的要求，操作简便，可推广用于植物中总黄酮的测定，具有良好的分析应用前景。
4.2榕树叶中富含多酚类物质，直接用硝酸铝比色法测定总黄酮含量时，会使结果偏高。采用荧光光度法测定榕树叶总黄酮含量，可排除一些常见金属离子的干扰，并考察了溶剂、pH、三氯化铝用量、放置时间对荧光强度的影响，进一步提高了测定结果的准确性。
4.3实验结果表明，榕树叶中含有较为丰富的黄酮，榕树分布广泛。因此，榕树叶具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用加强资源开发。
(来源：现代科学仪器|http://www.ms17.cn
榕树(Banyan)，是桑科榕属无花果类植物，全世界有800多种，主要分布在热带亚热带地区。我国榕属植物约100种，是热带雨林中的关键种类。榕 树叶，性凉，主治感冒、风热、肠炎、痢疾、百日咳、咽喉肿痛、湿疹、痔疮及麻疹不透［6］。研究表明［7］，黄酮类化合物是榕树叶的主要有效成分之一，具 有多种生物活性。榕树叶含三萜苷、黄酮苷、酸性树脂、鞣质、多酚类等，其中黄酮类和内酯类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消 除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品。目前对银杏类黄酮的研究较多，但对于榕树叶黄酮类化合物的研究还相 对缺乏［7］。
近年来，有关榕树叶总黄酮含量的检测采用紫外分光光度(UV)法［7］，紫外分光光度(UV)法的实验原理是根据 黄酮类物质与铝离子形成稳定的络合物，并产生特征吸收光谱而进行测定。该方法虽然操作简便，成本低，但是，由于榕树叶中成分复杂，富含多种酚类物质，对吸 光值产生干扰，影响实验结果的准确性［8］。因此，为了寻求操作简便、成本低、更加准确的检测方法，本文根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合 物，提出采用荧光光度法测定总黄酮的含量。
1材料与设备
960MC型荧光光度计(上海精密科学仪器有限 公司)，SHBIII型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，FA1104型电子天平(上海天平仪器厂)，索氏提取器，芦丁对照品(中国生物制 品检定所)，榕树叶(小叶榕)，200505采自右江民族医学院附属医院院内，经100℃烘干12h，粉碎，备用；其他试剂均为分析纯。
2原理和方法
2.1原理
紫外分光光度(UV)法的原理是根据黄酮类物质与铝离子形成稳定的络合物，并产生特征吸收光谱而进行测定。由于榕树叶中天然成分复杂，含有多种酚类化合 物，可与铝离子发生络合反应，形成干扰,使测定结果偏高。为此，本文根据黄酮类化合物能与铝离子形成稳定的荧光络合物，提出采用荧光分析法测定榕树叶总黄 酮含量，并进行干扰实验及回收实验证明实验原理。
2.2方法
2.2.1样品溶液的制备
精密称取榕树叶样品0.5000g，置索氏提取器中，适量石油醚加热回流30min，弃去石油醚提取液，并于温水浴中挥干残留的石油醚。然后加 50ml60%的乙醇加热回流提取1h，过滤，用60%乙醇定容至100ml。吸取样品溶液0.5ml，置于10ml容量瓶中,加入5%的AlCl3溶液 3ml，pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，用60%的乙醇定容，摇匀。
2.2.2芦丁对照品溶液的准备
精密称取芦丁对照品10mg，用60%的乙醇溶解，定容为100ml，即配成浓度为100μg?ml1的对照溶液。准确吸取对照溶液 0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml分别置于10ml容量瓶中，加入5%的AlCl3溶液3ml，pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，用 60%的乙醇定容，摇匀，即配成芦丁对照品溶液。
2.3测定在波长λ=460nm条件下［9］，测定芦丁对照工作溶液的荧光强度，以荧光强度对相应的浓度作图，绘制工作曲线，然后在相同的条件下测定样品中总黄酮的荧光强度，再用回归方程求出含量。
3结果
3.1测定条件的选择
3.1.1三氯化铝的加入量
黄酮类化合物与铝离子可生成稳定的荧光络合物，本实验考察了AlCl3的用量。实验表明，用5%的AlCl3溶液加入1~3ml为宜，本实验选择AlCl3的加入量为3ml。
3.1.2pH值的影响
溶液的pH值影响络合物的形成和荧光强度。在实验中发现，当溶液呈酸性pH为4~6时，溶液荧光强度最大，所以，实验中选择加入pH为4的醋酸醋酸钠缓冲液1ml。
3.1.3溶剂的影响
醇溶剂是黄酮类化合物最常用的提取溶剂,实验考察了不同浓度的乙醇溶液对荧光强度的影响。实验结果表明，当乙醇浓度达到60%以上,溶液荧光强度变化较小,考虑到成本因素,我们选用60%的乙醇作溶剂。
3.1.4静置时间的影响
将溶液静置于室内避免阳光直射并控制不同时间测定芦丁对照品溶液的荧光强度。实验结果表明，溶液荧光强度在50min内略有增加,然后有平缓下降趋势。所以,选择静置50min为最佳测定时间。
3.1.5干扰实验
实验了常见的金属离子对测定的干扰。结果表明，加入100倍的K ，Ca2 ，Mg2 对黄酮的测定无影响，但100倍的Fe3 对测定的干扰很大。
3.2工作曲线
实验表明，在0~20μg?ml1范围内有良好的线性关系,其线性回归方程为Y=0.4500X 17.5333，式中:Y表示荧光强度，x表示芦丁的浓度(μg?ml1)。相关系数r=0.9976,说明荧光强度与相应的浓度线性显著相关。
3.3样品测定及回收率实验
按实验方法测定了榕树叶总黄酮的含量,并对样品溶液进行平行测定(n=5)。结果见表1。表1榕树叶中总黄酮含量及精密度测定含量(略)
为了验证实验的准确性，在样品溶液中加入芦丁对照品进行回收实验，并计算回收率，结果见表2。由表2可知，荧光分析法测定榕树叶中总黄酮含量的平均回收率在99.8%~100.3%之间,实验结果准确可靠，说明本方法可行。表2样品回收率实验结果(略)
4结论
4.1实验结果表明，荧光光度法测定榕树叶总黄酮的含量,方法灵敏度高,其准确性、重现性、线性关系、稳定性都很好，能达到科研和生产的要求，操作简便，可推广用于植物中总黄酮的测定，具有良好的分析应用前景。
4.2榕树叶中富含多酚类物质，直接用硝酸铝比色法测定总黄酮含量时，会使结果偏高。采用荧光光度法测定榕树叶总黄酮含量，可排除一些常见金属离子的干扰，并考察了溶剂、pH、三氯化铝用量、放置时间对荧光强度的影响，进一步提高了测定结果的准确性。
4.3实验结果表明，榕树叶中含有较为丰富的黄酮，榕树分布广泛。因此，榕树叶具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用加强资源开发。
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