高效液相色谱法测定大气颗粒物中的杂环胺

【摘要】建立了大气颗粒物中杂环胺的高效液相色谱检测方法。采用ODSC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，乙腈?0.01mol/L三乙胺缓冲溶液(pH4.0)为流动相，非线性梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测波长263nm，并优化荧光激发和发射波长条件，实现了6种杂环胺的基线分离和4种杂环胺的高灵敏度荧光检测。本方法中荧光和紫外检测器的检出限分别为0.0018～0.0084mg/L和0.093～0.609mg/L(S/N=3)，相关系数在0.9920～0.9999之间，RSD小于5.9%，平均回收率为75.3%～111.6%，回收率相对标准偏差为1.7%～2.3%，具有较高的精确度和准确度。
　　
　　【关键词】杂环胺，高效液相色谱法，大气颗粒物
　　
　　1引言
　　
　　杂环胺(Heterocyclicamines，HAs)是一类在肉类、家禽、鱼类等食物烹调加工时产生的具有致突变性和致癌性的化合物[1]。其致癌性比黄曲霉毒素、亚硝酸胺高几十倍，也远高于苯并(a)芘(BaP)。大多数杂环胺已被证明可致实验动物多种器官的癌变(如肝癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、口腔癌和胃癌等)[2]。国外自20世纪70年代开始陆续出现杂环胺的研究报道，多集于食物方面[3～5]，并且已从烹调食品中分离鉴定了近20种杂环胺，但含量极低(以ng/g计)[5]。文献[6～8]报道，HAs还存在于大气颗粒物、雨水、土壤、香烟烟雾、柴油机排放颗粒物、垃圾处理厂焚烧的飞灰中，这些事实充分说明这类物质可能是普遍存在的环境污染物，并由各种物质如食物、垃圾、木材、草、石油等燃烧形成。随着人们对环境中致突变和致癌性物质健康效应和环境效应的逐渐关注，HAs的形成及影响因素[9]、暴露水平及评价[10]、生物标志物[11,12]、生物活性[13]、作用机理[14,15]、降解与活化[16]等各方面的研究日益深入。
　　
　　为了评价HAs对人类的潜在危险性，分离和检测食品和环境样品中的HAs非常重要。鉴于样品的复杂成分及HAs的痕量水平，通过色谱技术进行分析成为了较好的研究手段。目前，对HAs研究的方法主要有气相色谱?质谱法(GC?MS)、液相色谱?质谱法(LC?MS)和高效液相色谱法(HPLC)等[17,18]。GC?MS被认为是分析HAs最灵敏的技术，但是许多杂环胺属极性、难挥发的物质，需要衍生为低极性化合物才利于吸收，而目前提出的酰基化、烷基化、硅烷化等衍生化技术大多处于发展阶段[19]，限制了该方法的推广。LC?MS已成功应用于大多数HAs的检测，但LC?MS需要繁杂和/或昂贵的仪器，许多实验室达不到要求，故也有用液相色谱?荧光光谱法(LC?FL)[20]和液相色谱?电化学法(LC?ED)[21]分析HAs的研究报道。相比较而言，HPLC成为分析HAs的较为理想的检测手段。因所有HAs都具有紫外吸收光谱和电化学氧化性，一部分还有荧光特性，可用紫外(UV)、电化学(ED)或荧光(FL)检测器进行检测[22,23]。杂环胺的大多数定量分析方法是基于HPLC?UV，对于具有荧光的HAs，采用FL和UV联用，有助于排除干扰，提高定性分析的准确性。
　　
　　我国自20世纪80年代开展了食物中HAs的研究，但仅有极少报道[24,25]，而对于环境样品中HAs的分析一直处于空白阶段。本研究利用高效液相色谱?荧光?紫外串联技术对已报道在环境样品中含量较高的6种HAs进行了分析，建立了快速、简便、准确检测大气颗粒物PM10中HAs的高效液相色谱法，为开展杂环胺的相关研究提供了参考。
　　
　　2实验部分
　　
　　2.1仪器与试剂
　　
　　Aglient1100型高效液相色谱仪、紫外检测器(VWD)和荧光检测器(FLD)、Agilent化学色谱工作站(美国Aglient公司);pH?3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);十万分之一电子天平(德国Sartorius公司);RE?52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
　　
　　6种杂环胺(纯度>99%，加拿大TorontoResearchChemicals公司)，其名称、结构及美国化学文摘服务登陆号(CAS)见表1;乙腈、二氯甲烷、三乙胺(TEA)和H3PO4(色谱纯，美国DimaTechnology公司);正己烷、甲醇及三氯甲烷(北京化工厂);Al2O3(100～120目，在马弗炉中400℃烘4h)和层析硅胶(60～80目，在马弗炉中150℃烘4h)为分析纯。水为二次蒸馏水。表1杂环胺标样的名称、分子量及结构
　　
　　2.2样品采集与前处理
　　
　　样品采集使用PM10?PM2.5型颗粒物采样器(北京迪克机电技术有限公司)，校正流速77.49L/min，流量误差≤5%，采样时间72h，检出限为0.09μg/m3。采样用的玻璃纤维滤膜(Φ90mm，使用前于马弗炉500℃灼烧2h)在采样前后用天平准确称量，质量差即为颗粒物重量，然后滤膜放入冰箱避光、冷冻(-20℃)保存。
　　
　　大气颗粒物中有机质的提取参照文献[26]并加以改进。将采样滤膜用二次精馏的三氯甲烷索氏抽提72h，提取液浓缩至4mL左右，转移，吹干，放入干燥器中干燥并恒重，然后添加正己烷滤去不溶的沥青质。滤液浓缩后移至硅胶?Al2O3层析柱中，分别用正己烷、正己烷?二氯甲烷(1∶2，V/V)、乙醇?三氯甲烷依次冲淋出饱和烃、芳烃和非烃组分。各组分进一步浓缩、吹干，于-20℃冷冻保存。
　　
　　野外空白和实验室系统空白中主要污染物为邻苯二甲酸酯，但不影响待测物的分析。
　　
　　2.3溶液配制
　　
　　精密称取6种HAs标准品各1.0mg，分别用乙腈溶解定容至10mL，配成浓度为0.1g/L标准储备液，将储备液采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标样。用二次蒸馏水将1.39mL三乙胺定容至1000mL，并用H3PO4调节pH值。将冷冻保存的非烃样品取出，放置至室温，用1mL乙腈溶解，配制成一定浓度的溶液，待上机分析。
　　
　　2.4色谱条件
　　
　　AglientODSC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol/L三乙胺(H3PO4调节pH=4.0)缓冲液，非线性梯度淋洗，优化后的梯度淋洗程序见表2。柱温：30℃;流速：1mL/min;进样体积：20μL。紫外检测波长：263nm。表2梯度洗脱程序
　　
　　3结果与讨论
　　
　　3.1色谱条件的确定
　　
　　3.1.1流动相的选择采用乙腈?0.01mol/L三乙胺(H3PO4调节pH=3.4)为二元流动相。向流动相中加入少许碱性物质(三乙胺)，可消除拖尾影响，缩短保留时间，提高谱峰的对称性。考察了V(乙腈)∶V(H3PO4?三乙胺)=5∶95，10∶90，20∶80，30∶70，40∶60及50∶50的情况。随着乙腈比例提高，保留时间缩短，峰形得到改善，但6种HAs无法分离;而当配比低于10∶90时，主峰变宽，分离效果下降。鉴于6种HAs化学结构、性质以及在色谱柱中的保留时间相近，确定非线性梯度淋洗，优化后的梯度淋洗程序见表2，在此条件下AαC和MeAαC已完全分离，IQ与MeIQ基本分离(分离度R=1.91)，PhIP和Trp?P?2未完全分离，但已获得较好分离效果，故以此条件作为下一步实验的基础。
　　
　　3.1.2pH值的选择将H3PO4?TEA缓冲溶液的pH值分别设为3.0，3.4，3.8，4.0和4.4，结果表明：当pH=3.0时，各HAs的保留时间前移，较低的pH值有助于减小氨基化合物与硅胶表面硅羟基的作用，使峰形更尖锐。在此情况下，IQ与MeIQ的分离度为1.68，但PhIP和Trp?P?2不能有效分离，在FLD上合为一个峰。逐步提高pH值，PhIP和Trp?P?2间分离度增大(表3)。当pH=4.4时，PhIP和Trp?P?2已达到完全基线分离，但各峰的峰形变宽，灵敏度下降。综合考虑，选择pH=4.0的H3PO4?TEA缓冲溶液。表3pH值对PhIP和Trp?P?2分离的影响
　　
　　3.1.3流动相流速的选择流动相的流速对各物质的保留时间有较大影响。分别设定流速为0.5，1.0和1.5mL/min。结果表明，随着流速增加，柱压增高，保留时间缩短，但分离度降低。综合考虑分离度、保留时间和峰形等因素，流动相的流速定为1.0mL/min，6种物质在20min内即可完成分离。
　　
　　3.1.4检测波长的选择由于IQ与MeIQ不能发射荧光，而其它4种HAs能够发射荧光，故采用荧光?紫外串联检测，保证6种组分均能定量分析，同时双检测器有助于排除干扰，提高准确性。经反复实验，确定紫外检测波长为263nm，并优化了PhIP，Trp?P?2，AαC和MeAαC的荧光激发波长和发射波长(表4)。
　　
　　3.1.5其它条件的选择在优化的色谱条件下，选择柱温30℃，进样量20μL，得到HAs标准品的色谱图(图1)。结果表明，本研究建立的HPLC?VWD?FLD检测方法采用梯度条件进行洗脱，程序波长荧光检测器进行检测，使6种HAs获得良好的分离，并且出峰时间短，尤其是FLD检测的峰形尖锐，对称性好。表4荧光检测波长
　　
　　3.2标准曲线及线性关系
　　
　　将6种HAs标准储备液配制成0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和15.0mg/L系列浓度的混合标准溶液，在确定的色谱条件下进样，以HAs峰面积(A)对浓度(c)进行线性回归，得到6种HAs的标准工作曲线、相关系数、线性范围(表5)。从表5看出，6种HAs的相关系数都均大于0.9920，说明荧光检测器、紫外检测器在线性范围内峰面积与浓度有良好的相关性，可满足定量分析的需要。表5HAs的线性回归方程、相关系数及线性范围
　　
　　3.3检出限、精密度和回收率
　　
　　以S/N=3对应浓度作为仪器检出限;取0.5，1.0和5.0mg/L3个浓度水平的HAs混标分别重复进样5次，计算相对标准偏差(RSD)。取同一大气颗粒物样品2份，一份直接测定，另一份添加适当浓度的6种HAs混标后测定各成分含量，每份样品平行测定3次，考察方法的回收率，结果见表6。从表6可见，PhIP，Trp?P?2，AαC和MeAαC在荧光检测器的检出限(0.0018～0.0084mg/L)低于紫外检测器检出限(0.093～0.609mg/L)几个数量级。各HAs的相对标准偏差(RSD)均小于5.9%，说明本方法的重复性较好。平均加标回收率为75.3%～111.6%，回收率相对标准偏差为1.7%～2.3%，具有较高的准确度。表6仪器检出限、精密度和回收率
　　
　　3.4实际样品分析
　　
　　在上述色谱条件下，对北京大气颗粒物PM10样品中的非烃进行检测，结果见表7。由表7可见，不同采样点大气颗粒物样品中HAs的含量及各组分的分布均有差异。本方法灵敏、准确、可靠，适用于大气中痕量HAs的分析，对开展HAs的研究具有一定意义。表7样品测定结果