宁夏苦豆子根的高效液相色谱指纹图谱研究

　　　【摘要】目的建立宁夏苦豆子根的指纹图谱分析方法。方法采用高效液相色谱法以ZORBAXSB-C18(250mm×6mm，5μm)为色谱柱；流动相为乙腈∶0.1%H3PO4 0.1%(C2H5)3N，梯度洗脱；流速1.0ml·min-1；检测波长215nm；柱温30℃。结果用梯度洗脱得到的色谱图各色谱峰分离效果较好，达到指纹图谱要求。结论为更好地控制宁夏苦豆子的内在质量提供了可靠的分析方法。

　　【关键词】苦豆子指纹图谱高效液相色谱

　　Abstract:ObjectiveToestablishafingerprintanalysismethodofrootsofSophoraalopecuroidesL.MethodsThefingerprintwasperformedbyHPLC.ZORBAXSB-C18columnwasused；themobilephasewascomposedofCH3CN,0.1%H3PO4and0.1%(C2H5)3Nwithgradientelution；flowratewas1.0ml·min-1；thedetectionwavelengthwas215nm；thecolumntemperaturewas30℃.ResultsHPLCfingerprintofSophoraalopecuroidesL.wasobtained.ConclusionAreliablemethodisprovidedforthequalityconorolofSophoraalopecuroidesL.

　　Keywords:SophoraalopecuroidesL.；Fingerprint；HPLC

　　苦豆子SophoraalopecuroidesL.,别名苦豆根、苦豆草、欧苦参,是豆科槐属植物，为多年生草本，根茎地下芽旱生耐盐植物［1］。苦豆子主要药效成分是生物碱，药理研究证明,苦豆子生物碱具有显著的抗肿瘤、抗心律失常、抗菌、增强抵抗力和免疫力、抗变态性炎症和抗乙肝、升高白血球等药理作用［2］。临床用于治疗痢疾、湿疹、顽癣、滴虫、外伤化脓及胃痛等［3］。

　　中药指纹图谱能够较全面地反映中药化学成分，是目前国际公认的鉴定中药质量的有效方法。宁夏具有丰富的苦豆子资源，但目前有关苦豆子生物碱指纹图谱的研究还未见报道。本实验采用HPLC方法，选择宁夏境内不同产地具有代表性的10批次苦豆子样品进行了分离分析，以其中共有峰作为评价指标，首次建立了苦豆子药材生物碱的指纹图谱，其分离度和重现性均较好，可为苦豆子GAP基地质量标准的建立提供一定理论依据。

　　1器材与方法

　　1.1仪器与试药

　　Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；UV2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；AP-01P真空泵(AutoScience(天津)有限公司)。

　　相似度计算软件：国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版。

　　实验用水为重蒸水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

　　氧化苦参碱与苦参碱对照品：由宁夏紫荆花盐池药厂提供，HPLC检测为单峰，归一化法计算纯度达98%以上。苦豆子样品由宁夏盐池药厂提供，样品来源见表1。表1样品来源(略)

　　1.2供试品溶液的制备精密称定苦豆子药材粉末2.0000g，置具塞锥形瓶中，加75%乙醇80ml，在30℃，40kHz功率下超声提取30min，抽滤，将滤液蒸干，加入甲醇溶解并定容至10ml，离心，取上清液，0.45μm滤膜过滤，即得。

　　1.3对照品溶液的制备精密称取苦参碱和氧化苦参碱各0.0100g，以甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，摇匀，即得。

　　1.4色谱条件色谱柱为ZORBAXSB-C18柱(250mm×6mm，5μm)；流动相为乙腈(A)∶水〔1000mlH2O 1.0mlH3PO4 1.0ml(C2H5)3N〕(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表2。柱温30℃，流速为1.0ml·min-1，检测波长215nm，进样量10μl，以峰面积定量。表2梯度洗脱时间(略)

　　2结果

　　2.1检测波长的确定取上述对照品溶液，通过紫外可见分光光度计全波段扫描，结果显示对照品溶液在215nm处有最大吸收，确定检测波长为215nm。

　　2.2对照品色谱图分别取苦参碱及氧化苦参碱混合对照品溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。见图1。

　　2.3精密度、稳定性及重复性实验取同一份样品溶液(3号)，按拟定的色谱条件，连续进样5次，记录其色谱图，导出各色谱数据，用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算整体相似度，结果得到精密度的相似度在0.996～0.999之间，符合指纹图谱的要求。

　　取同一份样品溶液(2号)，分别在0，4，12，18，24h进样，按拟定的色谱条件进行测定，记录其色谱图，导出各色谱图数据，计算整体相似度，结果得到稳定性的相似度在0.995～0.998之间，符合指纹图谱的要求。

　　取样品(3号)5份，精密称定，超声法制备各供试品溶液，按拟定色谱条件进行测定，记录其色谱图，导出各色谱图数据，计算整体相似度，结果得到重复性的相似度在0.901～0.967之间，符合指纹图谱的要求。

　　2.4指纹图谱及各项技术参数

　　2.4.1指纹图谱

　　按上述方法分别检测10批不同产地苦豆子样品的根，按拟定色谱条件进行测定，导出各色谱图数据，匹配后，见图2。

　　由图2结果可见，10批样品的色谱峰在0～30min之间并无明显差异，具有较高的相似性，而在30～60min之间，其色谱图有一定差异，表明了不同产地苦豆子根所含化学成分基本相似，但个别成分之间还是有一定差异性。

　　2.4.2共有指纹峰的确立及相对保留时间和峰面积计算通过国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析苦豆子根的10批样品HPLC色谱图，确定了14个共有峰作为可以构成指纹图谱的稳定的特征峰，见图3。

　　共有峰的相对保留时间［4］：以图谱中氧化苦参碱为参照物(S)，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批苦豆子样品中各色谱峰的相对保留时间。结果见表3。表310批苦豆子根共有峰的相对保留时间(略)

　　共有峰的相对峰面积［5］：以图谱中氧化苦参碱为参照物(S)，将各色谱峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积。分别计算10批苦豆子样品指纹图谱中各色谱峰的相对峰面积。结果见表4。表410批苦豆子根共有峰的相对峰面积(略)

　　2.4.3相似度计算

　　采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件计算，得到10批样品的对照图谱，每1份样品图谱与对照图谱相比较，得到每1份样品的相似度。10批药材中，6号样品根的指纹图谱相似度最低，仅为0.682，其余9批相似度在0.703～0.908之间。

　　3讨论

　　苦豆子是宁夏的主要中药材之一，在宁夏具有丰富的资源。从苦豆子中提取苦参碱、氧化苦参碱及总生物碱，并将其加工成各种药剂，销往全国各地，市场份额占到全国70%以上，给宁夏地区带来了很好的经济效益，在宁夏医药工业中占有很重要的地位［2］。中药材化学成分因其品种、产地的不同而有一定的变化，中药指纹图谱是鉴定中药质量的有效方法。为了能更好地管理规范中药市场，保护宁夏苦豆子资源，本文从宁夏盐池、中宁、马家滩和冯记沟等地采集不同品种的苦豆子，用HPLC法建立了宁夏苦豆子药材指纹图谱的分析方法，通过相似度软件分析，建立其指纹图谱，为宁夏苦豆子质量标准的制定提供一定参考。

　　本实验采用75%乙醇超声法处理样品，采用HPLC方法，以乙腈-0.1%磷酸(加入三乙胺)为流动相进行梯度洗脱，分离得到30多个峰，用国家药典委员会的相似度评价系统软件计算，得到14个特征峰。

　　通过相似度软件计算，结果表明，10批样品的相对保留时间的重复性较好，但相对峰面积相差较大，说明不同产地的苦豆子中生物碱的含量有较大的差异。

　　本实验采用计算机软件对结果进行评价，与以往采用人工分析法相比，具有简便、准确、省时等优点。

　　通过建立苦豆子生物碱类成分的指纹图谱，既可利用其特征峰有效地鉴别药材的真伪，又可根据其内在质量的差异，以达到控制不同批次、产地的药材。