高效液相色谱法测定青蒿不同部位山柰素含量

　　　【摘要】目的建立高效液相色谱法测定青蒿中山柰素的含量，并对青蒿不同部位的山柰素含量进行比较。方法岛津VP?ODS色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，乙腈-0.2%磷酸溶液(35∶65)为流动相，测定波长367nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，进样量20μl。结果山柰素在0.0218～0.436μg范围内呈现良好的线性关系(r=0.9999)，平均回收率为98.70%，RSD为1.20%。结论该方法简便可行，重复性好，专属性强，可用于青蒿中山柰素的含量测定。测定结果表明，青蒿叶中山柰素的含量最高，花次之，根较少，茎最低。

　　【关键词】高效液相色谱法；青蒿；山柰素

　　Abstract：ObjectiveToestablishHPLCmethodforthedeterminationofkaempferolinQinghaoandanalyzekaempferolcontentindifferentpartsofQinghao.MethodsKaempferolinQinghaowasdeterminedbyHPLCwithVP-ODScolumn(150mm×4.6mm,5μm).ThemobilephasewasAcetonitrile-0.2%H3PO4(35∶65)solution.Thedetectionwavelengthwas367nm.Thecolumntemperatarewas30℃,theflowratewas0.8ml/min,andthesamplingvolumewas20μl.ResultsLinearityofKaempferolwasgood(r＝0.9999)inrangeof0.0218～0.436μg.Theaveragerecoverywas98.70%，RSDwas1.20%.ConclusionThemethodissimple，accurate，repeatableandsuitableforthedeterminationofkaempferolinQinghao.TheresultsshowthatthehighestcontentofKaempferolisinleaf，flowersthesecond，lessroots，stemstheminimum.

　　Keywords：HPLC;Qinghao;Kaempferol

　　青蒿为传统清热解暑要药，来源于菊科蒿属植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分［1］，性味苦寒，归肝、胆、肾经，具清热、祛暑、除蒸、截疟等功效，临床上主要用于治疗阴虚发热、暑热外感、疟疾、湿热黄疸诸证。青蒿药用历史悠久，全国各地均有分布。古代本草记载中除有青蒿地上部分供药用外，还有青蒿根的药用记录［2］；民间验方中亦有使用青蒿根治疗多种疾病的情况。因此，青蒿这味因青蒿素而备受人们关注的药迫切需要我们的深入研究，拓展其药用价值。

　　青蒿的化学成分种类较多，主要含有挥发油、倍半萜内酯类、黄酮类、香豆素类等。目前，青蒿中的挥发油、青蒿素和香豆素类成分如东莨菪内酯等［3］均有其成分分析和含量测定的报道，但是，黄酮类成分的相关报道却未曾见过。山柰素为青蒿中黄酮类化合物之一，具有抗癌［4］、抗炎等药理活性，能反映青蒿的部分功效，因此，可作为一个指标成分进行分析。本文首次建立了青蒿中山柰素的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法，并对青蒿不同部位(叶、花、根、茎)的山柰素含量进行分析和比较，为青蒿药材和制剂的质量控制提供参考。

　　1仪器与试药

　　岛津(SPD-10A，LC-10AT)高效液相色谱仪；UV1100紫外－可见分光光度计。山柰素对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用)；乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

　　青蒿药材采自四川省安岳县青蒿基地，经笔者鉴定为菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥全株。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件色谱柱：岛津VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈－0.2%磷酸溶液(35:65)；测定波长367nm；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量：20μl。在该条件下，山柰素色谱峰与相邻色谱峰达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数(N)按山柰素峰计算为4000以上。对照品和样品色谱图见图1。

　　2.2线性范围的考察精密称取山柰素对照品适量，加甲醇制成每毫升含山柰素0.02mg的溶液，即得。将上述对照品溶液制成一系列不同浓度的对照品溶液，分别进样20μl，按上述色谱条件测定其峰面积。以山柰素进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，求得标准曲线的回归方程为：Y＝5000000X－98335，R＝0.9999。结果表明，山柰素在0.0218～0.436μg范围内呈良好线性关系。

　　2.3供试品溶液的制备取青蒿药材粉末1.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴锅中加热回流60min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液25ml，加5ml25%盐酸，水浴回流30min,迅速冷却至室温，移置50ml容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

　　2.4精密度实验精密吸取对照品溶液20μl，连续进样6次，依法测定，记录峰面积，RSD为0.80%。

　　2.5重复性实验取同批药材6份，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，依法测定，记录峰面积，计算山柰素的含量，平均含量为0.6751mg/g，RSD为1.14%。

　　a-山柰素对照品b-青蒿样品

　　图1HPLC色谱图

　　2.6稳定性实验

　　2.6.1对照品溶液的稳定性实验精密量取山柰素对照品溶液，分别于0，5，10，15，20，25h进样20μl，测得山柰素峰面积值，RSD为0.92%。表明对照品溶液在25h内稳定。

　　2.6.2供试品溶液的稳定性实验取青蒿全株粉末1.0g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，分别于0，5，10，15，20，25h进样20μl，测得样品中山柰素峰面积值，RSD为1.13%。表明供试品溶液在25h内稳定。

　　2.7加样回收率实验取已知含量的青蒿全株样品粉末9份，每份约0.5g，精密称定，分别加入山柰素对照品(21.8μg/ml)10，15，20ml，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，并依法测定。计算回收率，结果山柰素的平均回收率为98.70%，RSD为1.20%。3种水平9次实验的加样回收率测得结果均在95%～105%之间，说明山柰素的提取和检测方法可行。

　　2.8样品测定分别吸取对照品溶液和青蒿不同部位(叶、花、根、茎)的供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并计算山柰素的含量。结果见表1。

　　3讨论

　　通过紫外分光光度计对山柰素对照品的甲醇溶液，在200～400nm波长范围内进行扫描。结果发现，山柰素在215，268及367nm处均有吸收峰，由于215nm接近溶剂末端吸收，干扰较大，268nm波长下干扰峰较多，分离度较差，而在367nm处灵敏度高，杂质干扰小，最后选择367nm为含量测定的检测波长。

　　实验中参考相关文献［5～8］，考察了供试品溶液制备方法，比较了不同提取方法、不同提取溶剂、不同提取时间、不同溶剂体积，最后确定以甲醇回流提取效果较好。青蒿中的黄酮类化合物以苷元及苷的形式存在，因此，本实验采用酸水解后，再测定苷元的含量。表1青蒿的叶、花、根、茎含量测定结果

　　色谱条件考察时，比较了不同比例的甲醇－0.2%磷酸溶液，结果样品峰分离度均较差。经过多次试验摸索，最终确定以乙腈－0.2%磷酸溶液(35∶65)作为含量测定的流动相，在该条件下得到的色谱峰峰形尖锐，分离度高。

　　本文首次建立了青蒿中山柰素的HPLC含量测定方法，并且进行了方法学考察，结果显示该方法准确度高、专属性强、灵敏度及稳定性均较好，测定方法可靠，测定结果能客观反映青蒿药材中山柰素的含量。由该方法下测定的结果可见，青蒿叶中山柰素含量最高，花次之，根较少，茎最低。

　　山柰素为青蒿中黄酮类成分之一，对其含量测定方法的研究，丰富了青蒿除青蒿素外其它有效成分研究的内容，为青蒿药材的开发利用提供了科学依据。本文仅对青蒿中的一种黄酮类成分进行了研究，今后还应进一步对其化学成分、药理作用等进行全面的研究，为青蒿的系统开发奠定基础。