高效液相色谱法测定止痢宁片中苦参碱的含量
【摘要】目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定止痢宁片中苦参碱的含量。方法采用C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，以乙腈－水(1000ml水加2ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0)(4∶96)为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，检测波长为220nm。结果在建立的色谱条件下，苦参碱与杂质能完全分离，苦参碱线性范围为18.712～299.392μg/ml(r＝0.9999)，平均回收率为101.60％，RSD为0.8％。结论此法简便准确，专属性好，可用于止痢宁片中苦参碱的含量测定。
【关键词】止痢宁片苦参碱高效液相色谱法
止痢宁片是由穿心莲、苦参、木香组成的半浸膏片，具有清热祛湿、行气止痛等功效［1］，穿心莲和苦参均为其中的主药。本品已收载于卫生部《药品标准中药成方制剂》第四册，其质量标准中未有含量测定项。国内已有关于该药中脱水穿心莲内酯含量测定的研究报道，而未见关于苦参碱含量测定的报道，为更好地控制止痢宁片的质量，本课题组研究建立了HPLC法测定制剂中苦参碱的含量的方法，该方法简便、准确、专属性好，能有效地控制制剂的内在质量。
1仪器与材料
高效液相色谱仪：Agilent1200(带有Agilent化学工作站)；十万分之一电子天平(Sartoriuscp225D)。苦参碱对照品(批号：110805-200306，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂为分析纯。
止痢宁片分别为A：陕西白云制药有限公司(批号：070501)；B：修正药业集团股份有限公司(批号：070603)；C：四川禾邦阳光制药有限责任公司(批号：070801)；D：吉林省跨海生化药业制造公司(批号：20070402)。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性色谱柱：奥泰ODSC18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈－水(1000ml水加2ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0)(4：96)；流速：1.0ml/min；检测波长220nm；柱温40℃；进样量10μl。苦参碱的保留时间为5.0min，与邻峰分离度大于1.5，理论板数不低于2500。阴性对照无干扰。色谱图见图1。
2.2溶液的配制
2.2.1对照品溶液称取苦参碱对照品约23mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2供试品溶液取本品10片，精密称定，研细，取约1片量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，浓氨1.0ml，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
a?对照品溶液；b?供试品溶液；c?阴性对照溶液；1.苦参碱
图1苦参碱的HPLC图
2.2.3阴性对照液按止痢宁片处方，制成缺苦参的阴性样品，照“2.2.2”项制备方法制得阴性对照液。
2.3线性关系考察精密吸取苦参碱对照品储备液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，16.0ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取稀释液，进样10μl，以苦参碱浓度(单位：μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得苦参碱的回归方程为：A=3.5569C-10.812，r=0.9999。苦参碱在18.712～299.392μg/ml范围内线性关系良好。
2.4精密度实验精密吸取苦参碱对照品储备液6.0ml，置25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度。在上述色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，RSD为1.7％(n=6)。
2.5稳定性实验取供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8h测定，苦参碱峰面积的RSD为1.7％，表明样品溶液在8h内稳定。
2.6重复性实验取同一批样品，制备5份供试品溶液，在上述色谱条件下测定，苦参碱的含量分别为3.54，3.58，3.48，3.50，3.42mg/片，平均含量为3.50mg/片，RSD为1.6％，表明本方法重现性良好(n=5)。
2.7加样回收率实验精密称取已知含量的样品，共6份，分别精密加入苦参碱适量，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备6份溶液，依上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。
2.8样品测定取4个厂家的样品，分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标法计算样品中苦参碱的含量，结果见表2。表1加样回收实验结果表2样品测定结果
3讨论
苦参中氧化苦参碱的含量远远高于苦参碱，达到20倍以上［2］，但氧化苦参碱不稳定，经加水煎煮转变为苦参碱［3］，因在本品的生产工艺中苦参为加水煎煮提取，所以以苦参碱的含量作为控制指标。
3.1色谱条件的选择本实验分别对3个流动相系统进行考察，①乙腈－磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾1.36g，加1ml三乙胺，加水至1000ml，磷酸调pH5.5)②乙腈－水(1000ml水加3ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.5)(4：96)③乙腈－水(1000ml水加2ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0)(4：96)。结果表明，流动相①、②系统中苦参碱峰拖尾严重，峰形很差，而流动相③系统中苦参碱峰形较好，苦参碱色谱峰能与相邻峰达到基线分离，所以选择流动相③系统。
实验中，柱温分别设定为25，35，40，45℃，结果柱温为45℃时苦参碱峰与相邻杂质峰未达到基线分离，在25，35，40℃时均可达到基线分离，且柱温在40℃时，不但色谱峰峰形佳，而且保留时间相对来说较适宜，所以选择柱温为40℃。
3.2提取方法的选择根据游离生物碱在碱性条件下易溶于有机溶剂的特性，选用浓氨试液将生物碱提出。实验中考察了加浓氨0.5，1.0，1.5，2.0ml4种方法，结果加浓氨1.0ml较0.5ml测得的苦参碱含量高，与1.5，2.0ml无明显差异，故选择加浓氨1.0ml。因苦参碱易溶于甲醇，实验比较了加甲醇25，50，75ml，结果显示甲醇50ml较25ml提取的苦参碱含量高，与75ml无显著差异，故选择加甲醇50ml。超声提取时间分别设定为15，20，30min，以20min提取最为理想。
实验结果表明，不同厂家生产的样品中苦参碱含量差异很大，最高与最低相差近250%，可能与制剂生产工艺、药材的产地、生长年限、采集时间等因素有关。建议在该药质量标准中增加含量测定项，以达到控制质量的目的。
(来源：现代科学仪器|http://www.ms17.cn
【关键词】止痢宁片苦参碱高效液相色谱法
止痢宁片是由穿心莲、苦参、木香组成的半浸膏片，具有清热祛湿、行气止痛等功效［1］，穿心莲和苦参均为其中的主药。本品已收载于卫生部《药品标准中药成方制剂》第四册，其质量标准中未有含量测定项。国内已有关于该药中脱水穿心莲内酯含量测定的研究报道，而未见关于苦参碱含量测定的报道，为更好地控制止痢宁片的质量，本课题组研究建立了HPLC法测定制剂中苦参碱的含量的方法，该方法简便、准确、专属性好，能有效地控制制剂的内在质量。
1仪器与材料
高效液相色谱仪：Agilent1200(带有Agilent化学工作站)；十万分之一电子天平(Sartoriuscp225D)。苦参碱对照品(批号：110805-200306，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂为分析纯。
止痢宁片分别为A：陕西白云制药有限公司(批号：070501)；B：修正药业集团股份有限公司(批号：070603)；C：四川禾邦阳光制药有限责任公司(批号：070801)；D：吉林省跨海生化药业制造公司(批号：20070402)。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性色谱柱：奥泰ODSC18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈－水(1000ml水加2ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0)(4：96)；流速：1.0ml/min；检测波长220nm；柱温40℃；进样量10μl。苦参碱的保留时间为5.0min，与邻峰分离度大于1.5，理论板数不低于2500。阴性对照无干扰。色谱图见图1。
2.2溶液的配制
2.2.1对照品溶液称取苦参碱对照品约23mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2供试品溶液取本品10片，精密称定，研细，取约1片量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，浓氨1.0ml，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
a?对照品溶液；b?供试品溶液；c?阴性对照溶液；1.苦参碱
图1苦参碱的HPLC图
2.2.3阴性对照液按止痢宁片处方，制成缺苦参的阴性样品，照“2.2.2”项制备方法制得阴性对照液。
2.3线性关系考察精密吸取苦参碱对照品储备液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，16.0ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取稀释液，进样10μl，以苦参碱浓度(单位：μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得苦参碱的回归方程为：A=3.5569C-10.812，r=0.9999。苦参碱在18.712～299.392μg/ml范围内线性关系良好。
2.4精密度实验精密吸取苦参碱对照品储备液6.0ml，置25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度。在上述色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，RSD为1.7％(n=6)。
2.5稳定性实验取供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8h测定，苦参碱峰面积的RSD为1.7％，表明样品溶液在8h内稳定。
2.6重复性实验取同一批样品，制备5份供试品溶液，在上述色谱条件下测定，苦参碱的含量分别为3.54，3.58，3.48，3.50，3.42mg/片，平均含量为3.50mg/片，RSD为1.6％，表明本方法重现性良好(n=5)。
2.7加样回收率实验精密称取已知含量的样品，共6份，分别精密加入苦参碱适量，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备6份溶液，依上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。
2.8样品测定取4个厂家的样品，分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标法计算样品中苦参碱的含量，结果见表2。表1加样回收实验结果表2样品测定结果
3讨论
苦参中氧化苦参碱的含量远远高于苦参碱，达到20倍以上［2］，但氧化苦参碱不稳定，经加水煎煮转变为苦参碱［3］，因在本品的生产工艺中苦参为加水煎煮提取，所以以苦参碱的含量作为控制指标。
3.1色谱条件的选择本实验分别对3个流动相系统进行考察，①乙腈－磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾1.36g，加1ml三乙胺，加水至1000ml，磷酸调pH5.5)②乙腈－水(1000ml水加3ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.5)(4：96)③乙腈－水(1000ml水加2ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0)(4：96)。结果表明，流动相①、②系统中苦参碱峰拖尾严重，峰形很差，而流动相③系统中苦参碱峰形较好，苦参碱色谱峰能与相邻峰达到基线分离，所以选择流动相③系统。
实验中，柱温分别设定为25，35，40，45℃，结果柱温为45℃时苦参碱峰与相邻杂质峰未达到基线分离，在25，35，40℃时均可达到基线分离，且柱温在40℃时，不但色谱峰峰形佳，而且保留时间相对来说较适宜，所以选择柱温为40℃。
3.2提取方法的选择根据游离生物碱在碱性条件下易溶于有机溶剂的特性，选用浓氨试液将生物碱提出。实验中考察了加浓氨0.5，1.0，1.5，2.0ml4种方法，结果加浓氨1.0ml较0.5ml测得的苦参碱含量高，与1.5，2.0ml无明显差异，故选择加浓氨1.0ml。因苦参碱易溶于甲醇，实验比较了加甲醇25，50，75ml，结果显示甲醇50ml较25ml提取的苦参碱含量高，与75ml无显著差异，故选择加甲醇50ml。超声提取时间分别设定为15，20，30min，以20min提取最为理想。
实验结果表明，不同厂家生产的样品中苦参碱含量差异很大，最高与最低相差近250%，可能与制剂生产工艺、药材的产地、生长年限、采集时间等因素有关。建议在该药质量标准中增加含量测定项，以达到控制质量的目的。
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