反相高效液相色谱法测定蒲薏颗粒中咖啡酸含量

　　　【摘要】目的建立测定蒲薏颗粒中咖啡酸含量的方法。方法色谱柱LichrospherC18(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-水-磷酸(7∶100∶0.1)为流动相，检测波长：323nm,柱温：40℃,流速：1min·ml-1。结果咖啡酸在0.0053～0.848mg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9999)；平均加样回收率为97.75%，RSD=2.88%。结论该方法操作简便，结果准确，适用于蒲薏颗粒中咖啡酸的含量测定。

　　【关键词】咖啡酸蒲薏颗粒反相高效液相色谱

　　蒲薏颗粒是由蒲公英、生薏苡仁、生何首乌、灵芝、三棱组成的复方制剂，具有清热解毒、活血化瘀、补益气血之功效。用于消化道肿瘤的放疗、化疗的辅助治疗，临床适宜病证见皮肤红斑、色素沉着、脱发、恶心、呕吐、口舌生疮、精神疲惫、面色无华，舌红偏紫，舌苔薄腻，脉弦细数等热毒炽盛、血行瘀滞、气血不足者，也可用于消化道肿瘤非放、化疗时而见上述证情者。蒲公英为蒲薏颗粒中的主药，而《中国药典》2000年版收载的蒲公英含量测定指标成分为咖啡酸。为控制产品质量，我们对制剂中咖啡酸的含量测定方法进行了研究。

　　1仪器与试药

　　1.1仪器高效液相色谱仪系统(岛津LC-10Avp)，包含2台LC-10ATvp泵；SPD-10Avp紫外检测器，7725i手动进样阀，TC-100柱温箱(天津特纳科技公司)，WML色谱工作站(广西威玛龙色谱科技公司)；超声波清洗器(250W，29～34kHz；北京医疗设备二厂)；METTLERAE240电子天平［梅特勒-脱利多仪器(上海)有限公司］等。

　　1.2试药

　　咖啡酸对照品购自中国药品生物制品检定所(批号：885-200102；规格：供含量测定用)。乙腈(色谱纯)，甲醇、磷酸、氯仿等为分析纯。蒲薏颗粒由贵阳医学院药物研究所提供(批号：20030306，20030310，20030312)。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件色谱柱为LichrospherC18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-水-磷酸(7∶100∶0.1)；检测波长323nm［1］；柱温40℃；流速1.0mg·ml-1；进样量10μl；咖啡酸的保留时间(tR)约为25min。

　　2.2对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品10.60mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得每毫升含0.1060mg的对照品储备液。

　　2.3供试品溶液的制备取装量差异项下的样品，研细，取约2.0g，精密称定，精密加水25ml，超声处理(250W，29～34kHz)20min，摇匀，离心，取上清液5ml置干燥的离心试管中，加氯仿5ml，密塞，漩涡混合5min，离心，取上清液用滤膜(0.45μm)滤过，即得。

　　2.4阴性溶液的制备按处方比例和生产方法制成缺蒲公英的样品，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制成阴性溶液。

　　2.5干扰性实验分别取咖啡酸对照品溶液、制剂供试品溶液及缺蒲公英药材的阴性对照液各10μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果供试品色谱与对照品色谱相应的保留时间处有吸收峰，而阴性溶液无吸收峰，说明阴性无干扰。见图1。

　　2.6线性关系考察精密吸取上述咖啡酸对照品储备液0.5，1，2，4，8ml分别置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得系列对照品工作液。分别精密吸取上述系列对照品工作液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X(mg·ml-1)为横坐标，得回归方程为Y＝44000097X-25772，r=0.9999，在0.0053～0.848mg·ml-1范围内，进样浓度与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.7精密度实验精密吸取咖啡酸对照品溶液(0.01060mg·ml-1)10μl注入色谱仪，重复进样5次，测定咖啡酸，结果咖啡酸平均峰面积为438974，RSD为1.47%。

　　2.8稳定性实验取同一供试品溶液10μl，分别于0，1，2，4，8h进样测定峰面积，结果供试品溶液中咖啡酸在4h内稳定不变。

　　2.9重复性实验取同一批号样品供试品，按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，分别进样测定，结果样品中咖啡酸的平均含量为0.0952mg·g-1，RSD为2.81%。

　　2.10回收率实验采用加样回收法。精密称取已测定含量的同一批样品(平均含量0.0952mg·g-1)5份，精密加入咖啡酸对照品适量，按制剂供试品溶液制备方法制备5份供试液，分别进样10μl。结果见表1。表1制剂供试品中咖啡酸的回收率实验(略)

　　2.11样品的测定分别精密吸取咖啡酸对照品溶液和供试品溶液适量，经0.45μm微膜过滤，分别进样10μl，测定，计算蒲薏颗粒中咖啡酸的含量。结果见表2。

　　表2蒲薏颗粒咖啡酸的含量测定结果(略)

　　3讨论

　　3.1供试品溶液制备方法的选择制剂中蒲公英药材已经过提取，其中咖啡酸以游离形式存在，根据咖啡酸溶解于水、甲醇、乙醇等性质［2，3］，在样品提取中，分别考察了水、不同浓度的甲醇为提取溶剂，结果以水为提取溶剂的效果较好。水提取液经氯仿除杂进样和酸化后用醋酸乙酯提取等方法实验，后者回收率偏低。用氯仿提取后的水溶液测定时杂质干扰较小，回收率高。以水为提取溶剂，分别超声处理不同时间后，用氯仿提取，将水溶液直接进样分析，实验结果表明，超声处理20min可将制剂中咖啡酸提取完全，故制剂采用水超声处理20min，氯仿除杂的水溶液作为供试品溶液。

　　3.2色谱条件的选择分别采用了KromasilC18(5μm，200mm×5mm)、DiamonsilC18(5μm，250mm×4.6mm)和LichrospherC18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱，分别以甲醇-磷酸盐缓冲溶液、乙腈-0.1%磷酸为流动相，结果以乙腈-水-磷酸(7∶100∶0.1)，LichrospherC18色谱柱，柱温40℃，分离效果较好。