分光光度法测定藏药鬼箭锦鸡儿中总黄酮的含量

　　【摘要】目的建立藏药鬼箭锦鸡儿中总黄酮的含量测定方法。方法采用正交实验设计，以总黄酮含量为考察指标，研究藏锦鸡儿总黄酮的最佳提取方法;并利用分光光度法，以芦丁为对照品，对藏锦鸡儿原药材中的总黄酮含量进行测定。结果该药材红色木质部心材中总黄酮的含量为13.56%。结论该工艺合理，黄酮有效成分提取率高。该方法测定样品结果准确可靠、快速、重复性好。

　　【关键词】藏药 鬼箭锦鸡儿 总黄酮 分光光度法

　　藏锦鸡儿学名鬼箭锦鸡儿Caraganajubata(Pall)Poir，藏名“作毛兴”，为豆科锦鸡儿属植物，是叶型较小的中生、中旱生、旱生和沙生灌木。生长在海拔3000~4700m的阴坡、半阴坡地带[1~3]。藏医用其根茎及其干燥红色木质部心材入药，其味涩、性凉。具有活血散瘀、凉血、降压、生肌止痛的功能，可用于防治多血症、血热症、高血压病和心血管等方面的疾病[4]。鬼箭锦鸡儿中含有黄酮类、皂苷、生物碱、鞣质、挥发油和糖类等化学成分[5]。本文采用正交实验法研究了鬼箭锦鸡儿中总黄酮的最佳提取条件，同时对其总黄酮含量进行了测定[6~8]。

　　1仪器、试剂及样品采集

　　1.1仪器与试剂722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);分析天平;芦丁(中国药品生物品检定所);乙醇等试剂均为分析纯;常用玻璃仪器等。

　　1.2样品采集鬼箭锦鸡儿采自海拔4000m以上的青藏高原地区(青海省藏药研究所多杰研究员鉴定)，去掉外皮，取红色木质心材，切断，阴干，粉碎后过40目筛作为实验药材。

　　2方法与结果

　　2.1对照品芦丁标准溶液的制备精密称取芦丁标准样品0.0250g，75%乙醇溶解并定容至100ml容量瓶中稀释到刻度。

　　2.2最大吸收波长的确定取芦丁标准溶液4ml采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色,在470~560nm波长范围内测定溶液的吸光度。测定结果见表1。由此可见，在510nm处有最大吸收值,所以,可以选择510nm作为检测波长。

　　2.3正交实验

　　2.3.1正交实验设计方案选择乙醇浓度(A)，回流时间(B)，药材重量与乙醇体积比(C)为实验3个考察因素，每个因素取3个水平(见表2)，应用L9(34)表安排实验，以鬼箭锦鸡儿中总黄酮的含量为评价指标，研究其最佳提取条件。

　　表1不同波长下芦丁标准溶液对应的吸光度(略)

　　表2总黄酮提取条件因素水平(略)

　　2.3.2正交实验结果正交实验数据及计算分析见表3。直观分析表明，影响鬼箭锦鸡儿总黄酮提取率的主要因素依次为：乙醇浓度>物料比>回流时间，其中乙醇浓度对总黄酮的提取率有显著影响，最佳提取条件为A2B1C2。

　　2.4藏锦鸡儿药材中黄酮提取方法的确定准确称取已粉碎过筛后的藏锦鸡儿红色木质心材10g于烧瓶中，加入100ml石油醚回流40min进行脱脂，弃去滤液，再加入100ml75%的乙醇，回流提取30min，3次，弃去滤渣，合并滤液后进行蒸馏浓缩，用75%乙醇定容至250ml量瓶中，得总黄酮提取物，用于含量的测定。

　　2.5实验测定条件的选择

　　2.5.1氢氧化钠溶液用量的选择精密吸取芦丁标准溶液2ml各4份，分别置于25ml容量瓶中，各加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，再加10%硝酸铝1.0ml，然后分别加入10%氢氧化钠5，10，15，20ml，再用75%乙醇溶液稀释至刻度，分别在510nm处测定其吸光度(见表4)。经实验考察结果，选择测定时加入10%NaOH10ml时为最佳。

　　2.5.2硝酸铝溶液用量的选择同以上方法，在装有标准溶液的4份样品中，各加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，再分别加入10%硝酸铝溶液0.5，1.0，1.5，2.0ml，然后分别加入10%氢氧化钠10ml。实验结果见表5。由此可知，实验选择Al(NO3)3加入量为1.5ml为最佳。

　　2.5.3反应温度的选择同以上方法，取芦丁标准溶液1份，加1.0ml5%亚硝酸钠溶液，1.5ml10%硝酸铝溶液，10%氢氧化钠10ml，分别在室温及20，30，40℃时测定溶液吸光度值(见表6)。由此可知，温度对实验测定没有太大的影响，所以选择室温下进行样品测定。

　　表3正交实验数据及计算分析结果(略)

　　表4不同氢氧化钠用量时芦丁标准溶液的吸光度(略)

　　表5不同硝酸铝用量时芦丁标准溶液的吸光度(略)

　　表6不同温度下芦丁标准溶液的吸光度(略)

　　2.6标准曲线的绘制精密吸取芦丁标准溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml分别置于25ml容量瓶中，各加1.0ml5%亚硝酸钠溶液，摇匀放置5min，加1.5ml10%硝酸铝溶液，摇匀放置5min，再加10%的氢氧化钠溶液10ml,然后用75%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀放置10min后，分别在510nm处测定其吸光度。应用最小二乘法，以浓度C(mg/ml)与吸光度A进行线性拟合，得回归方程A=12.737C-0.0035，相关系数r=0.9996(n=7)。

　　2.7精密度实验取浓度为0.02mg/ml的芦丁对照品溶液，在本实验条件下连续测定6次，测出其吸光度A值，计算得RSD=0.98%(n=6)。

　　2.8重复性实验精密称取鬼箭锦鸡儿样品10g，共6份，按上述方法处理,测定其吸光度A值，得RSD=1.03%(n=6)。实验结果表明本方法的重复性满足要求。

　　2.9稳定性实验精密称取鬼箭锦鸡儿样品10g，按上述“2.6”项下方法处理，分别在2，4，6，8，10h时测定其吸光度A值，表明样品溶液在10h内稳定。

　　2.10回收率实验精密称取6份已知含量的鬼箭锦鸡儿样品10g，依次加入对照品溶液适量，按正文操作方法，测得其平均回收率为101.4%(n=6)，RSD=1.24%。

　　2.11药材中总黄酮含量的测定准确吸取试样1ml4份，分别置于50ml容量瓶中，其中1份用75%的乙醇定容至刻度，作为参比溶液。其余3份按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法进行显色，在波长510nm处分别测定其吸光度值。代入标准曲线回归方程可得浓度数据，经计算后得藏锦鸡儿原药材中总黄酮含量。上述3份溶液的平均吸光度值为1.378(见表7)，相应的浓度为0.1085mg/ml，则总黄酮的含量为13.56%。

　　表7藏锦鸡儿中总黄酮含量的测定(略)

　　3讨论

　　根据正交实验结果可知，鬼箭锦鸡儿总黄酮的最佳提取条件为选用75%的乙醇作为溶剂，以1∶10的物料比，回流30min，重复3次,合并滤液,浓缩后定容。

　　经实验表明，鬼箭锦鸡儿总黄酮实验测定条件的选择为：加5%的亚硝酸钠溶液1.0ml，10%的硝酸铝溶液1.5ml，10%的氢氧化钠溶液10ml时为最佳。

　　本实验采用分光光度法测得鬼箭锦鸡儿去皮红色木质心材中总黄酮平均含量为13.56%。其药材中黄酮含量高的主要原因是由于本实验药材选取的是鬼箭锦鸡儿红色木质部心材部分，致使测定的鬼箭锦鸡儿药材中总黄酮含量较高;其次，是分光光度法测定的是药材中所有黄酮苷和苷元的总含量，而鬼箭锦鸡儿药材中可能除此之外，还含有其它类型的黄酮类成分;另外，本实验采用碱性介质中加铝盐显色的分光光度方法，并且经过优化实验条件，也使测得的总黄酮的含量比较高和准确。

　　鬼箭锦鸡儿在我国的许多地区都有广泛分布，资源丰富，且在民间有很好的用药经验，若能再对其根、茎、叶、花的化学成分和药理活性进行深入的研究,将更加有助于促进鬼箭锦鸡儿资源的综合开发和可持续利用，同时对生态环境也有一定的保护作用。