荧光分光光度法测定大黄中游离蒽醌的含量

　　有效成分含量是评价药材质量的重要指标，现报道的大黄中游离蒽醌检测方法主要有比色法、薄层色谱(TLC)法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管胶束电泳色谱法(MECC)及毛细管电泳色谱法(CEC)。色谱方法通常需要较长的分离分析时间，与之相比光谱法具有显而易见的快速特点;同时荧光分光光度法可用于药物的微量或恒量物质分析，并具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简便等优点，因此在药物定量尤其是中药有效成分检测上的应用日趋广泛。已有利用荧光分光光度法测定中药决明子中总蒽醌含量测定的报道[1]。本实验利用羟基蒽醌的荧光特性，在丙酮溶液中，建立了中药大黄中游离蒽醌荧光测定的新方法。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器电子天平(上海精密科学仪器有限公司FA1004型)，KQ-500B型超声器(昆山市超声仪器有限公司)，LD4-2型低速离心机(北京医疗离心机厂)，RE-52A型旋转蒸发器(上海正荣生化仪器厂)，970CRT荧光分光光度计(上海精密仪器有限公司)。

　　1.2 材料1，8?二羟基蒽醌对照品(中国药品生物制品检定所)，95%乙醇(沈阳市东陵区红日化工厂)、丙酮(盛森试剂有限公司)均为分析纯，大黄药材(购自锦州市药材公司)，水为亚沸高纯去离子水。

　　2 方法与结果

　　2.1 测定波长的选择用2 ml 3.1 μg/ml的1，8?二羟基蒽醌标准液在300～600 nm波长范围内进行激发波长扫描，蒽醌的最大激发波长(λex)为460 nm，固定该激发波长，扫描得发射谱图，得到其发射波长(λem)为540 nm。结果见图1。

　　图1 蒽醌标准液的激发波长和荧光波长(略)

　　选择该最大激发波长和最大发射波长(即λex/λem=460 nm/540 nm)作为后继测定的工作条件。

　　2.2 标准曲线的制备精密称取105℃干燥至恒重的1.8?二羟基蒽醌2.5 mg置50 ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀得对照原液。精密量取对照原液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml分别置10 ml棕色容量瓶中，用丙酮定容，以丙酮试剂为空白，在λex =460 nm 和λem=540 nm处测其溶液的荧光强度，结果表明溶液的荧光强度(IF)与溶液浓度(C)在0.25～3.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。见图2。

　　图2 游离蒽醌荧光强度标准曲线图(略)

　　2.3 条件考察

　　2.3.1 溶剂的影响 选择丙酮、甲醇、氯仿试剂，考察了对反应体系的影响，结果表明样品在丙酮中荧光强度大、灵敏度高，且空白溶剂在此范围内几乎无荧光吸收(与文献报道一致[2])，在激发波长为460 nm、发射波长为540 nm处，其拉曼光较小，对实验影响较小，图像也较直观，故本实验选用丙酮作溶剂，见图3。

　　图3 丙酮、甲醇、氯仿荧光效果图(略)

　　2.3.2 放置时间对游离蒽醌荧光强度的影响依照分析步骤,测定放置不同时间后的1，8-二羟基蒽醌的相对荧光强度。结果见表1。从表1中可以看出,随着放置时间的延长，相对荧光强度逐渐减小，荧光强度在0～3 h内基本稳定，因此应保证在3 h内测定荧光。

　　表1 放置时间对游离蒽醌荧光强度的影响(略)

　　2.4 样品的测定

　　2.4.1 样品溶液的制备取摄氏60℃干燥1 h的大黄粗粉80 mg，加50 ml 95%乙醇，先在25 kHz频率下超声20 min，然后水浴上加热至微沸，回流1.5 h，采用3 000 r/min的转速离心30 min，取上清液，残渣再加50 ml 95%乙醇液加热回流30 min，离心取上清液，合并两次上清液，浓缩后挥去乙醇，残渣加二次蒸馏水10 ml，1 mol/L NaOH 2滴、氯仿15 ml，分离后将水溶液于冰水浴中并加乙醚10 ml、盐酸0.4 ml后立即密封振摇3 min，静止分层，如此方法萃取3次合并乙醚液，挥尽乙醚后加50 ml丙酮，得样品溶液。

　　2.4.2 精密度实验分别精密吸取样品溶液1 ml于5个10 ml棕色容量瓶中，加丙酮定容。在λex/λem=460 nm/540 nm下测荧光强度。结果见表2。RSD为0.3%，表明该方法的精密度良好。

　　表2 精密度实验结果(略)

　　2.4.3 重现性实验精密称取大黄粗粉80 mg 5份，按样品溶液的制备项下的方法制备样品液，在λex/λem=460 nm/540 nm下测荧光强度。结果见表3。RSD为1.5%，表明该方法的重现性良好。

　　表3 重现性实验结果(略)

　　3 讨论

　　蒽醌母核是一个具有长共轭体系的化合物, 且游离蒽醌的结构上都有多个取代基-OH，更增加了分子的π电子共轭程度，故荧光强度较强;由于游离蒽醌在丙酮中的荧光强度较大、 稳定性好，无干扰， 故实验文选定丙酮为测定溶剂。

　　研究结果表明利用荧光分光光度法测定大黄中游离蒽醌的含量， 具有取样量小、操作简便、快速灵敏的特点 ,可用于人体血清、尿样中的大黄中游离蒽醌的定量分析。