可见光及紫外光分光光度法测定丁香总黄酮含量的研究

　　丁香Eugenia caryophyllata Thunb.又名丁子香、支解香、公丁香。丁香分布于马来群岛及非洲，我国广东、广西等地均有栽培。丁香中含有酚类、β石竹烯、甲基正戊基酮、水杨酸甲酯和黄酮等物质。丁香性温，味辛, 有温中、暧肾、降逆的功能 [1]。目前报道的测定植物中黄酮含量的方法主要是可见光分光光度法[2]，但可见光及紫外光分光光度法测定丁香总黄酮含量的方法未见报道。本文采用可见光与紫外光分光光度法测定丁香中总黄酮含量，并对两种方法进行了比较，拟寻找一种准确而简便的测定丁香中黄酮含量的方法。

　　1 仪器与试剂

　　1.1 仪器上海惠普6010型紫外可见分光光度计;上海二分7230G可见光分光光度计;北京赛多利斯电子分析天平;索氏抽提器;PHILIPS7120S粉碎机。

　　1.2 试剂与样品芦丁对照品从广州中医药大学药物化学研究所购买,芦丁含量≥98%;其它试剂均为分析纯。丁香样品购于广州，经粉碎后过60目筛，在60 ℃烘箱干燥6 h后冷却备用。

　　2 方法

　　2.1 样品处理精确称取丁香粉末1.000 0 g，在索氏抽提器中经石油醚脱脂到无色，放冷后转出石油醚，加入80 ml无水甲醇，抽提至无色。提取液全部转移到100 ml容量瓶，用无水甲醇定容作为试液待用。

　　2.2 可见光分光光度法标准曲线的制备 精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品250 mg, 用无水甲醇溶解,转移入250 ml容量瓶中, 用无水甲醇定容，摇匀.精确移取5.00 ml至50 ml容量瓶中，用无水甲醇定容，摇匀。此芦丁对照品溶液浓度为0.1 mg?ml-1。准确吸取0.1 mg?ml-1芦丁对照品溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 ml,分别置25 ml容量瓶中,各加50 %乙醇至6 ml，分别加5 %亚硝酸钠溶液1.00 ml，摇匀,放置6 min后分别加10%硝酸铝溶液1.00 ml，摇匀,放置6 min,再分别加1 %氢氧化钠溶液10.00 ml，再用50 %乙醇定容，摇匀，放置15 min后,以空白溶液为参比，在波长510 nm处测吸光度，得回归方程。

　　2.3 可见光分光光度法回收率实验 精密称取5份已知总黄酮含量的丁香粉末1.000 0 g,加入一定量的芦丁对照品,按照2.1所述制得样品液,按照2.2所述显色并测定吸光度, 由回归方程计算总黄酮含量,按回收率=(实测值-样品所含的总黄酮)/加入的芦丁×100 %。

　　2.4 可见光分光光度法样品的总黄酮含量测定分别准确吸取1.00 ml试液置25 ml容量瓶中, 按照2.2所述显色并测定吸光度，在510 nm波长处测定吸收度A,由回归方程计算样品中总黄酮含量。

　　2.5 紫外光分光光度法标准曲线的制备精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品96.4 mg， 用无水甲醇溶解，转移入100 ml容量瓶中, 用无水甲醇定容,摇匀.精确移取10.00～100 ml容量瓶中，用无水甲醇定容，摇匀。此芦丁对照品溶液浓度为0.096 4 mg?ml-1。 准确吸取浓度0.096 4 mg?ml-1芦丁对照品溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，6.00 ml， 分别置25 ml容量瓶中, 各加无水甲醇定容，在359 nm处测吸光度，得回归方程。

　　2.6 紫外光分光光度法回收率实验精密称取5份已知总黄酮含量的丁香粉末1.000 0 g,加入一定量的芦丁对照品,按照2.1所述制得样品液,用无水甲醇稀释样品液，在359 nm处测吸光度，由回归方程计算总黄酮含量,按回收率=(实测值-样品所含的总黄酮)/加入的芦丁×100 %。

　　2.7 紫外光分光光度法样品的总黄酮含量测定分别准确吸取1.00 ml试液置25 ml容量瓶中, 用无水甲醇稀释定容，在359 nm波长处测定吸光度A，由回归方程计算样品中总黄酮含量。

　　3 结果

　　3.1 可见光分光光度法将配制好的不同浓度的芦丁对照品溶液在510 nm波长处测定吸收度A，得回归方程为：A=-0.011 5 0.020 62C (A为吸光度，C为浓度mg?L-1)，相关系数r=0.999 7。这表明芦丁浓度在4 ～24 mg/L范围内线性良好。

　　3.2 紫外光分光光度法将配制好的不同浓度的芦丁对照品溶液在359 nm波长处测定吸收度A，得回归方程为：A=0.000 405 4 0.027 18C(A为吸光度，C为浓度mg?L-1)，相关系数r=0.999 7。这表明芦丁浓度在4～24 mg/L范围内线性良好。

　　3.3 样品的总黄酮含量测定 黄酮类化合物具有特定的紫外吸收带，其结构中的肉桂酰环产生的Ⅰ带在300～400 nm内，由苯甲酰环产生的Ⅱ带在240～285 nm内，不同的黄酮在这两个吸收带的吸收强度不同[3]。含黄酮类化合物的原料经一定的提取纯化后，可直接于最大吸收波长处测定其吸收度，以芦丁为对照品对照计算其含量[4]。本实验选择芦丁在Ⅰ带的最大吸收波长359 nm作为紫外光分光光度法的测量波长。取不同产地的丁香样品, 分别用可见光分光光度法和紫外光分光光度法对每个样品平行测定3次,RSD=1.09 %,各个样品的总黄酮含量结果见表1。

　　表1 不同产地的丁香样品的总黄酮含量测定结果(略)

　　从表1可见，不同产地的丁香全草的总黄酮含量有一定差异，其中以广东丁香2号黄酮含量最高,而广西丁香1号黄酮含量最低。用可见光分光光度法测得的总黄酮含量总是比用紫外光分光光度法测得的总黄酮含量要稍高，这可能因为可见光分光光度法是在强碱性溶液与铝离子反应后显色, 而丁香又含酚类,酚羟基在该条件下也能够与铝离子结合,在510 nm处也被吸收,这样就导致测定结果偏高[5]。

　　3.4 回收率实验 把一定量的芦丁对照品加入已知总黄酮含量的广东丁香2号中做回收率实验，由表2可见，回收率范围符合定量分析要求。

　　表2 广东丁香2号回收率实验结(略)

　　4 结论

　　实验结果表明，可见光分光光度法和紫外光分光光度法两种方法测定丁香总黄酮含量都有较好的线性关系。紫外光分光光度法能直接测定黄酮的含量，不需用硝酸铝显色，从而能够避免丁香中酚羟基的干扰，方法简便准确，是测定丁香总黄酮含量较佳的方法。