反相高效液相测定三七花中的人参皂苷Rb1含量

　　摘要：三七花是传统名贵中药五加科植物三七的花蕾，盛产于我国西部云南、广西、西藏等地，作为药材，民间用于治疗高血压病、咽痛音哑、津伤口渴等。经前期药效研究表明，其抗高血压病的有效部位为总皂苷。

目的为三七花质量标准研究打下基础。方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对三七花中人参皂苷Rb1含量进行测定。结果人参皂苷Rb1含量在8 h内基本稳定；精密度RSD为0.55%，重复性RSD为4.12%，高、中、低浓度组的回收率分别为102.88%，97.87%，103.57%。结论方法学考察结果符合质量分析的要求，可用于三七花中人参皂苷Rb1含量测定。

研究报道，从三七花中分得10种化合物，经化学和光谱方法确定为β-谷甾醇、胡萝卜苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷-Ⅸ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3等。三七花中人参皂苷含量最高，以人参二醇苷为主，其中又以人参皂苷Rb1较多［2］。对于人参皂苷Rb1的含量测定方法有高效液相色谱法、薄层扫描法、气相色谱法等［3］，HPLC法中CN柱和反相柱均可得到较好的分离。目前，关于三七的研究大都集中在其块根，块根也是现阶段三七产业的基本原料药物。由于三七花使用区域受限，使其药材资源的经济价值未被充分利用，因此研究也较为薄弱。本研究采用RP-HPLC方法作为三七花药材中人参皂苷Rb1的含量测定方法，以期为其质量标准的建立打下基础。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(1100化学工作站，美国安捷仑科技公司)；色谱柱Alltech Platinum C18 100A 5μm 250 mm×4.6 mm；试剂均为色谱纯。人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱Alltech Platinum C18 100A 5μm 250 mm×4.6 mm；流动相为乙腈-水(30∶70)；检测波长为203 nm。色谱图见图1～2。

2.2 供试品制备条件的考察

2.2.1 甲醇回流时间的考察考察了甲醇回流时间对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表1。依据结果，确定甲醇提取时间为4 h。表1 不同甲醇提取时间对含量测定的影响(略)

2.2.2 石油醚提取次数考察样品用甲醇提取后，提取液用石油醚(30～60℃)萃取除杂，10 ml/次，考察不同提取次数对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表2。依据结果，为缩短样品处理时间，确定石油醚提取次数为2次。

2.2.3 水淋洗用量的考察

考察不同水淋洗用量对糖类成分淋洗程度的影响。结果见表3。依据结果，确定水淋洗用量为70 ml。表2 不同提取次数的比较(略)表3 不同水用量的比较(略)

2.2.4 20%乙醇淋洗用量的考察考察不同20%乙醇淋洗用量对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表4。依据结果，确定20%乙醇淋洗用量为50 ml。表4 不同20%乙醇用量的比较(略)

2.2.5 80%乙醇洗脱用量及收集洗脱液量的考察考察不同80%乙醇洗脱用量及收集洗脱液量对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表5。依据结果，确定80%乙醇洗脱用量为80 ml，收集洗脱液70 ml。表5 不同80%乙醇洗脱用量及收集洗脱液量的比较(略)

2.3 供试品溶液的制备取三七花药材粉末(过3号筛)10 g，精密称定0.2 g，置索氏提取器中，加氯仿60 ml，加热回流1 h，弃去氯仿液，药析挥去氯仿，加甲醇55 ml，加热回流4 h，提取液挥干，加水10 ml溶解，加石油醚(30～60℃)提取2次，10 ml/次，弃取醚液，水液通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm,长15 cm)，以水70 ml洗脱，弃去水液，再用20%乙醇50 ml洗脱，弃去20%乙醇洗脱液，继用80%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液70 ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并定量转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 标准曲线的建立取人参皂苷Rb1对照品约11 mg，精密称定，用甲醇定容至10 ml容量瓶中，配制成浓度为1.16 mg·ml-1的对照品溶液。用甲醇逐级稀释成一系列浓度的标准液。按上述色谱条件进样HPLC分析，以峰面积(A)对含量(Y)进行线性回归，得标准曲线回归方程为Y=0.004 6A 0.112 9 r=0.999 9，线性范围为0.58～11.6 μg。

2.5 精密度实验取同一人参皂苷Rb1对照品溶液，连续进样6次，精密度为0.55%。

2.6 稳定性实验取同一供试品溶液，于0，2，4，6，8h分别进样，精密度为0.83%。

2.7 重复性实验取相同制法制备的同一批次5份样品进行测定，结果RSD为4.12%，表明重复性良好。

2.8 回收率实验于三七花粉末中加入适量人参皂苷Rb1对照品标准液形成高、中、低3个浓度的样品，按“2.3”处理后进行HPLC分析，计算人参皂苷Rb1的方法回收率，得回收率分别为102.88%，97.87%，103.57%。结果见表6。表6 回收率实验结果(略)

2.9 三七花药材含量测定取三七花药材粉末10 g，精密称定0.2 g，按上述测定方法进行HPLC测定。结果见表7。 表7 三七花药材含量测定结果(略)

3 讨论

本文曾以三七块根研究中常用的人参皂苷Rg1作为测定指标建立含量测定方法，但在实验中发现三七花中Rg1含量远少于Rb1，以其作为测定指标有所不妥，与文献报道相符。

由于三七花中所含组分较多，包括黄酮类、挥发油类、多糖类、氨基酸类等，且含有块根所没有的大量叶绿素，极易对测定造成干扰，故在供试品制备中选用D101型大孔吸附树脂，先用水洗去多糖，再用20%乙醇洗去黄酮类物质，最后收集80%乙醇洗脱液，结果表明可起到较好的纯化作用。

从研究结果看，云南文山的三七花总皂苷含量高于广西靖西，表明不同产地的药材有一定差异，选材时必须加以考虑。

(来源：中国化工仪器网)