食物中泛酸的测定方法

1.原理
泛酸对于Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）的正常生长是一种必需的营养素，在一定生长条件下，Lactobacillus plantarum的生长与繁殖速度同样品中泛酸的含量成一定的线性关系，通过利用浊度法或光密度法测定细菌增殖的强度即可间接地检测出食物样品中泛酸的含量。本方法最低检出限为5ng。

2.适用范围
本方法参考"Official Methods of Analysis of the Association of official Analytical Chemists"、"Methods of Vitamin Analysis"以及"Methods of the Microbiological Analysis of Selected Nutrients"。本方法适用于测定各类食物（包括天然食物及加工食物）及饲料中的泛酸含量。
3.试剂
本试验用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。
3.1甲苯
3.2 1mol/L盐酸溶液
3.3 Tris 缓冲溶液：将24.2三羟基氨基甲烷溶于150ml水中，用7.5mol/LNaOH调pH至 8.0~8.3，然后定容至200ml，贮存于4℃冰箱中，可保存2周。
3.4 7.5mol/L氢氧化钠溶液：溶150g氢氧化钠于水中，定容至500ml。
3.5 2mol/L醋酸：12ml冰醋酸用水定容至1000ml。
3.6 2mol/L醋酸钠溶液：将16.4g醋酸钠用水定容至1000ml。
3.7 2mol/L碳酸氢钾溶液：称取10.012g碳酸氢钾溶于水中，然后定容至500ml。
3.8 2%碱性磷酸酶溶液：称取2g碱性磷酸酶（Sigma公司 No.P-3877）溶于水中，然后定容至100ml。贮存于4℃冰箱中保存。
3.9 10%鸽子肝脏提取物溶液：将所用容器在配制此试剂前一天放入4℃冰箱中过夜。(1) 称取30g鸽子肝脏丙酮提取物粉末（Sigma公司, No.L-8376）放入冷的研钵中，分两次加入300 ml 0.2N KHCO3, 至0℃的冰浴中研磨均匀直至呈悬浊液；(2) 将此悬浊液分别放入8支离心管中，塞紧后充分振摇，冷冻10分钟，然后3000转离心5分钟；(3) 将上清夜放入500ml预冷的广口烧瓶中，加150g活性Dowex1-X8（Bio-Rad Laboratories, Inc., Brussels, Belgium）, 放在冰浴中震摇5分钟；将混合液倒入离心管中，3000转离心5分钟； (4) 再将上清液移入另一个冷的500ml广口烧瓶中，冷冻10分钟；(5) 重复上述(3)、(4)步骤一次；(6) 然后分装于试管中，冷冻条件下保存，用前化冻。
3.10 酸解酪蛋白液：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200ml 3 mol/L盐酸，于压力蒸汽消毒器内10.3×104Pa（15 lb/in2）压力下水解6小时。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，贮存于试剂瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。
? 酸解的目的是为了去除酪蛋白中的维生素，使基本培养基中不含待测定的维生素，但有时酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉，这样可较好地确保酸解酪蛋白中不含生物素。
3.11 胱氨酸-色氨酸溶液：称取4g L-胱氨酸和1g L-色氨酸（或2g DL-色氨酸）于800ml水中，加热至70-80℃，逐滴加入（1+5）的盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
3.12 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250ml烧杯中，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
3.13 吐温80溶液：将25g吐温溶于乙醇中并定容至250ml。
3.14 维生素溶液Ⅰ：称取20mg核黄素，10mg盐酸硫胺素，0.04mg生物素，用0.02mol/L 醋酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15 维生素溶液Ⅱ：10mg对氨基苯甲酸，50mg尼克酸，40mg盐酸吡哆醇，溶于（1+3）的乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 盐溶液A：称取25g磷酸二氢钾和25g磷酸氢二钾溶于500ml水中，加5滴浓盐酸。
3.17 盐溶液B：称取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO4 7H2O、23 ml 85% H3PO4，溶于水中并定容至500ml。
3.18 泛酸标准溶液

3.19 基本培养基：将下列试剂混合于500ml烧杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠液调节pH至6.8，用水稀释至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
胱氨酸、色氨酸溶液 25ml
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml
维生素溶液Ⅰ 5ml
维生素溶液Ⅱ 5ml
盐溶液A 5ml
盐溶液B 5ml
无水葡萄糖 10g
三水醋酸钠 8.3g
吐温80溶液 0.25ml
此培养基也可从Difco公司购得，产品号为0816-15-7。
? 由于国内的某些试剂纯度不够，所以自行配制的培养基较浑浊，严重影响到最后的浊度测定结果，因此建议使用进口培养基。
3.20 琼脂培养基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g无水葡萄糖，2g无水磷酸二氢钾，100ml番茄汁，10ml吐温80，加热溶解，用40%氢氧化钠调节pH为6.5~6.8，然后定容至1000ml，每500ml液体培养基加5.0~7.5g琼脂，于121℃高压灭菌10分钟，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱2-4℃条件下保存。
3.21 生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000ml水中，。每次使用时分别到入2~4支10ml试管中，每支约加10ml，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，备用。
3.22 0.04%溴麝香草酚蓝溶液：称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵内，加1.6ml 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
3.23 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4ml 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
3.24 0.1%溴酚蓝乙醇溶液：称取0.1g溴酚蓝，用乙醇溶解后，加乙醇稀释至100ml。
3.25 番茄汁：将新鲜番茄去皮、去籽，制成匀浆后，用纱布过滤数次，直至呈淡黄色透明液体，在液面上加几滴甲苯，冷冻保存。
4.仪器与设备
4.1 实验室常用设备
4.2 电热恒温培养箱
4.3 压力蒸汽消毒器
4.4 液体快速混合器
4.5 离心机
4.6 722分光光度计
4.7 硬质玻璃试管：20mm×150mm
5.菌种与培养液的制备与保存
5.1 储备菌种的制备：Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）接种于直面琼脂培养管中，在37±0.5℃恒温箱中培养16~24小时，取出后放入冰箱中保存，每隔两周至少传种一次。在实验前一天必须传种一次。
5.2 种子培养液的制备：加2ml泛酸标准工作液和3ml基本培养基于10ml离心管中，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，取出，冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用。
? 加入离心管中的泛酸标准液要适量，过少会影响Lactobacillus plantarum的生长，过多则不宜于洗净残余泛酸，因此会使零管中的光密度值增大，影响测定结果的准确性。一般2-3ml标准工作液即可。
6.操作步骤
6.1 接种液的配制：使用前一天，将已在琼脂管中生长16-24小时的L. plantarum接种于种子培养液中，在37±0.5℃培养16-24小时，取出后离心10分钟（3000rpm），弃取上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加入3ml灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入已灭菌的注射器中，立即使用。
6.2 样品制备：
称取适量样品，放入100ml三角瓶中，加10mlTris缓冲液，加蒸馏水30ml，混匀于121℃高压条件下水解15分钟，取出冷却至室温，定容至50ml，过滤。
? 泛酸在空气中稳定，但对于热不稳定，因此水解时间切勿过长。
取1ml样品液（5.2.1.），加入0.4ml碱性磷酸酶溶液，0.2ml肝脏提取物溶液，0.1ml 碳酸氢钠溶液，0.4ml蒸馏水，混匀后，37℃温箱中培养过夜。
加水至20ml，以溴甲酚绿为外指示剂，用冰醋酸调节pH=4.5，定容至25ml，过滤。
取适量水解液（5.2.3）于25ml具塞刻度试管中，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠调节至pH=6.8，用水定容至某刻度。
样品试管的制备：于平行样品管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0 ml样品水解液（5.2.4），加水至5ml，然后再加入5ml基本液体培养基。
6.3标准管的制备
每组试管中分别加入泛酸标准工作液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml（相当0.0、10.0、20.0、 30.0、 40.0、 50.0ng泛酸），加水至5ml，再加入5 ml基本液体培养基， 需做三组标准曲线。。
6.4灭菌：样品管与标准管均用棉塞塞好，于121℃高压灭菌10分钟。
? 灭菌时间不宜过长，否则会破坏基本培养基中的营养成分，影响Lactobacillus plantarum的生长，最好在5-10分钟内。
6.5 接种与培养：待试管冷至室温后，每管接种一滴种子液，于37±0.5℃恒温箱中培养16~20小时。
? （1）接种前，接种室要在紫外灯下消毒至少30分钟。（2）在接种时，其中一支标准系列0管可不接种，这样可观察此次实验是否存在污染，并且可消除由于管中液体的颜色造成的误差。
6.6 测定：722分光光度计，波长640nm条件下，以标准系列0管仪器调零，测定样品管及标准管的吸光度值。
? 首先以未接种的标准系列0管进行仪器调零，然后再用接种后的标准系列0管进行二次调零，之后再测定其他管中液体的光密度值。
7.计算
以泛酸标准系列的不同纳克数为横坐标，吸光度值为纵坐标，制做标准曲线。在曲线上查出相对应的样品测定管中的泛酸含量，然后再按以下公式计算样品中泛酸含量：
    C·V·F
X=-------------- ×100
     m×1000
式中
X ── 样品中泛酸含量，μg/100g：
C ── 测定管中的泛酸含量，ng：
V ── 样品水解液的定容体积，ml：
F ── 样品液的稀释倍数
m ── 样品质量，g。
100/1000 ── 单位换算系数