实时荧光定量PCR技术的应用

定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

1. 分子生物学研究

⑴ 基因表达研究：细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，包括对淋巴细胞激活、增生、分化、存活和凋亡的调节。这些低分子蛋白由淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞所分泌，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥反应等有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR检测细胞因子mRNA表达水平就显得很有意义。实验研究表明：定量结肠直肠癌淋巴结的癌抗原mRNA的表达量，可以作为诊断癌症微转移的重要依据。

⑵ 单核苷酸多态性(SNP)及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交，两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度(Tm)。这样便可对突变和多态性进行分析。拉米夫定是有效治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物，但临床应用中不断有病毒变异的报道，这些变异可能是治疗失败或病毒对治疗无反应的原因。实时荧光定量PCR可以监测乙型肝炎患者服用拉米夫定后体内是否产生耐药突变病毒。

2. 医学研究

⑴ 病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

⑵ 产前诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。

⑶ 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。

⑷ 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。

临床意义

1.      PCR技术在结核菌检测中的应用及意义
结核菌基因诊断的意义主要表现在：a. 区分TB与其它分枝杆菌；b. 检测TB耐药基因；c . 提高TB的阳性检出率。

2.      PCR技术在HBV检测中的应用及意义

1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。

2、是否复制。

3、是否传染，传染性有多强。

4、是否有必要服药。

5、肝功能异常改变是否由病毒引起。

6、判断病人是适合用哪类抗病毒药物。

7、判断药物治疗的疗效。

3.    PCR技术在HCV检测中的应用及其意义
HCV是引起输血后肝炎的主要致病因子，因其在血中的含量极低，仅为HBV的1%，其免疫学标志只有抗-HCV一项，且至今病毒分离尚未成功，所以HCV的检测较HBV困难的多，因此，PCR技术在HCV的检测出显得格外重要，其意义主要表现在：
3.1  抗-HCV可作为HCV感染诊断的指标。由于个体间免疫功能的差异，部分患者出现抗-HCV较晚，免疫功能低下者和经免疫抑制治疗者甚至可能不产生抗-HCV；因此HCV-RNA是HCV感染的确诊标志。据报道，在患者发病30-60天和6-30个ELISA抗-HCV的检出率分别为45%和67%，说明ELISA检出抗-HCV有相当高的漏检率。
3.2  在“窗口期”没有抗-HCV产生，但可检测出RNA。
3.3  HCV-RNA定量可指导用药，为疗效观察及预后判断提供客观指标。血清HCV拷贝高对干扰素不敏感，低敏感，据报道，HCV<100pg/ml组：11/30转阴HCV>100pg/ml组：1/30转阴。
HCV-RNA持续维持高水平状态可能预后不佳。
3.4  抗-HCV阳性并不能代表现症感染，丙型肝炎的诊断标准是HCV-RNA(+).

4.    PCR在CT检测中的应用
CT是非淋菌性尿道炎的主要病原微生物之一，有时还可引起不育等其它疾病。CT为专性细胞寄生性，一般培养不能生长，只有在活细胞内才能增殖复制，实验室通过Mcloy、Hela-229细胞培养观察包涵体，可认为是诊断“金标法”。但因操作复杂，技术要求高，需时间长，并不适于临床检测。免疫学方法有直接免疫荧光法、EIA法等，但这两种方法无论是检测抗原还是抗体阳性率均不足50%，用单抗会丢失位点、多抗有交叉反应，在高危人群筛查中常与金黄色葡萄球菌、链球菌、淋球菌等发生交叉反应使其特异性受到影响，因此，国内外专家一致认为CT的基因诊断方法应定为“金标准”。

5.      HAV为甲型病毒性肝炎的病原体。甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）为嗜肝RNA病毒。抗-HAV IgM和抗-HAV IgG等抗体成分为其血清标志物。[临床意义]  血液中抗-HAV IgM型抗体在发病后1~2周内出现，3个月后滴度下降，6个月后不易检出，该抗体阳性，即可诊断为急性甲型肝炎。抗-HAV IgG出现较抗-HAV IgM稍晚，一般终身存在，是一种保护性抗体，可用于甲肝的流行病学调查。

6.      丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）是一种RNA病毒。临床诊断HDV的血清标志物为HDV Ag、抗- HDV IgM 和抗- HDV IgG 等三种。健康人检查结果均为阴性。  H DV感染时，HDV Ag阳性。抗- HDV IgM 阳性，见于急性HDV感染。抗- HDV  IgG阳性，是诊断慢性丁肝的可靠血清学指标。

7.  戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）是一种RNA病毒。临床诊断HEV的血清标志物为抗- HEV IgM 和抗- HEV IgG。 健康人检查结果均为阴性。 抗- HEV IgM 阳性反应，可诊断急性戊肝，持续时间2~3个月。恢复期患者血清中可检出抗- HEV IgG，持续时间约1年。

8.    评价荧光定量PCR(QPCR)技术对不孕症妇女宫颈沙眼衣原体和解脲支原体检测意义.方法:用QPCR技术对60例不孕症患者(不孕组)及78例正常生育者(对照组)行宫颈沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)检测.结果:不孕组宫颈分泌物CTDNA、UUDNA及混合感染阳性检出率明显高于对照组(P＜0.05＝.结论PCR对不孕症患者宫颈CTDNA、UUDNA的检测特意性强、快速、灵敏,临床应用价值高.

9.    尖锐湿疣患者外周血中HPVDNA的检测尖锐湿疣（CA）病情顽固，极易复发。过去的研究一直认为HPV是严格的亲上皮病毒。但有人研究发现血液中能检出HPVDNA。中国医科大学附属第一医院皮肤科的研究人员推测尖锐湿疣在HPV感染的病程中可能存在病毒血症，可能是易感部位CA复发或其他部位出现CA病变的病毒来源。为此研究人员对30例CA患者外周血中HPVDNA进行了检测。方法：采用聚合酶链反应（PCR）检测30例CA患者皮损和外周血中的HPVDNA，20例正常人外周血作对照。采用限制性内切酶RsaⅠ、PstⅠ对HPV做分型鉴定。选取1例皮损与外周血均为阳性的PCR产物进行测序。结果：30例CA患者皮损均检出HPVDNA，血浆中未检测到HPVDNA，有8例外周血单一核细胞（PBMC）中检测到HPVDNA（阳性率为26.7％），20例正常人对照为阴性。两组阳性率经χ2校正检验χ2＝4.52，P＜0.05，差异有显著性。酶切和测序结果显示，PBMC中的HPV型别与其皮损处的型别有一致性。结论：CA患者在HPV感染的病程中可能存在病毒血症，这可能是CA易于复发的原因之一。本研究结果提示，病毒在局部大量繁殖有可能破坏局部基底膜带，通过真皮血管入血。此外，在PBMC中检测到HPV提示，该病可能有性传播以外的途径经血行传播的可能。

10.快速诊断将宫颈粘膜、皮肤、口腔、角膜等组织细胞涂片后，用特异性抗体作间接免疫荧光或免疫组化染色法检测病毒抗原；Wright-Giemsa染色镜检，如发现核内包涵体及多核巨细胞，可考虑HSV感染；将疱疹疱液进行电镜负染可迅速确诊。原位核酸杂交和PCR法可用于检测HSVDNA。PCR产物的特异性鉴定选用Southernblot法，脑脊液PCR扩增被认为是诊断疱疹性脑炎的最佳手段。此外，DNA酶切图谱也可作HSV鉴定和型别分析。HSV抗体测定对临床诊断意义不大，仅用于流行病学调查，

11.梅毒（TP），意义：敏感性、特异性均高。一般用来做确证试验。不能用于观察疗效：即使患者经过足够的抗梅治疗，血清学反应仍可保持阳性，甚至保持终生。

12.目的探讨聚合酶链反应(PCR)反向膜杂交技术检测临床标本中结核分支杆菌(TB)DNA的价值.方法用PCR反向膜杂交技术检测522例结核及60例非结核患者临床标本中的TBDNA,同时用培养、抗酸染色涂片及常规PCR法作对照.结果PCR反向膜杂交法阳性率为80.6%(411/690),培养为18.1%(125/690),镜检为13.9%(96/690),常规PCR为59.6%(411/690),PCR反向膜杂交法与常规法比较(P＜0.001＝,差异有显著意义.PCR反向膜杂交法阳性检出率高于常规PCR(P＞0.05),但差异无显著意义;该技术假阳性为零.结论PCR反向膜杂交技术检测临床标本中TB-DNA具有快速、高度特异性和敏感性,可为结核病的临床早期诊断提供一种新的病原学诊断手段.

13.近年来聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术已经用于Hp的诊断，该技术的敏感性比寡核苷酸探针增加了100倍，可以检出少至100个Hp。目前Hp的尿素酶基因和16SrRNA基因的部分序列已经测出，为PCR特异性引物的选择提供了依据。我们以一对与16SrRNA基因互补的寡核苷酸为引物（CP1/CP2），建立了从胃粘膜活组织标本中检测Hp感染的PCR技术。用该方法检测Hp标准菌株NCTC 11637，NCTC11848及50株从临床病人胃粘膜活组织中分离的Hp菌株均产生450bp的片段，其敏感性为0.1pg的HpDNA，相当于100个细菌细胞 ，而对12株非Hp菌株（包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌及空肠弯曲菌NCTC11351）以及无Hp感染的人胃粘膜细胞呈阴性反应。我们还用PCR检测了96例因上消化道症状而行胃镜检查的患者，结果表明PCR检查的Hp阳性率高于常规检查法。我们还对17例经不同方案治疗后用常规方法检查（尿素酶试验、银染、及培养均阴性）而被认为Hp被根除的病人，用PCR检查发现4例Hp阳性。以往我们对一些常规方法未能检出而实际上还存在Hp的病人，误认为Hp被根除而放弃治疗，这些病人短期内Hp再现实际上是治疗不彻底，这对于指导Hp感染的治疗有十分重要的临床意义。

14.HCMV感染是器官移植受者术后常见并发症之一。HCMV感染系全身感染，临床表现多样，与移植排斥反应的临床症状十分相似，易于混淆，但二者的产生条件截然相反，在治疗上完全不同。要弄清器官移植术后受者的临床症状是否由HCMV感染所致，及时诊断活动性HCMV感染非常重要。HCMV感染是影响器官或组织移植成败的重要因素。特别在骨髓移植感染中，如不及时诊治，常可引起致命危险和移植失败。因此早期诊断和及时有效的预防性治疗是降低移植术后HCMV病发生率和死亡率的关键。荧光定量PCR技术对HCMV DNA的检测对感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标，对于HCMV感染疾病的治疗和预防具有重要的意义。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。目前对HCMV感染疾病的治疗和预防主要采用抗病毒药物。显然对抗病毒药物的疗效需要有有效的观察和评价手段。荧光定量PCR对HCMV DNA可进行定量分析，检测指标稳定，通过对DNA血症水平的动态观察以监测HCMV疾病的发生、发展及预后，及时调整免疫抑制剂的用量，指导抗病毒治疗，观察疗效，分析是否有耐药等，因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的有力手段。