高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定烟草中的水溶性糖

1 引言
糖类物质是烟草中的一类重要化合物。烟草中的水溶性糖，尤其是还原糖，与烟草的香味、吃味及焦油生成量密切相关。不同类型、不同产地、不同部位的烟草，其水溶性糖的含量大小不同，导致了烟草品质间的差异性。随着市场对卷烟产品质量要求的不断提高，建立烟草中各种单糖和低聚糖的测定方法，对烟草生产、改善卷烟配方和吸烟与健康的研究具有实际意义[1]。目前，烟草中总糖和还原糖的测定方法主要有费林试剂法[2]、近红外分光光度法[3]、连续流动分析法[4]、毛细管电泳法[5~6]、气相色谱法[7]和高效液相色谱法[8~9]。高效液相色谱-示差折光检测法（RID）是一种快速、直接的糖分析方法，但RID基于色谱流出物光折射率的变化来连续检测样品浓度，要求恒温、恒流速，对工作环境要求较苛刻，无法进行梯度洗脱，且检测灵敏度不高。蒸发光散射检测器（ELSD）是一种质量检测器[10]，基于不挥发的样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比而进行检测，对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生末端紫外吸收的物质均能产生响应。ELSD稳定性好，灵敏度高，适宜于烟草中包括低含量的鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等在内的糖类物质分析。本文采用Waters高效糖分析柱、乙腈-水作流动相、蒸发光散射检测器，实现了烟草中8种水溶性单糖和二糖的同时测定。方法准确、简便、快速，具有较强的实用性。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统，四元梯度泵，Empower色谱工作站（美国Waters公司）；Alltech ELSD2000蒸发光散射检测器（美国Alltech公司）；Milli-Q50高纯水处理器（美国Millipore公司）；Sep-pak-C18固相萃取小柱（美国Waters公司）。
D-果糖、D-葡萄糖、L-甘露糖（Sigma公司）；麦芽糖、蔗糖、D-木糖（Supelco公司）；L-鼠李糖、DL-阿拉伯糖（Fluka公司）；各种糖标样的纯度均大于99%。乙腈、甲醇为色谱纯试剂（Tedia公司）。实验用水为高纯水。
配制质量浓度均为5g/L的鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等8种糖的标准储备水溶液，使用前用水稀释成40mg/L~2000 mg/L的工作溶液。
2.2 色谱条件
分析柱为Waters高效糖柱（WAT044355，250mm×4.6mmi.d.,4μm）,配有预柱（WAT046895，12.5mm×4.6mmi.d.,4μm），Waters公司产品。
流动相为乙腈：水=70：30，流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量10μL；ELSD的漂移管温度80℃，氮气作载气，流速2.00L/min。
2.3 样品处理
称取40~60目的烟草样品1g，准确至0.0001g，加入25mL的高纯水，超声波作用下浸提40min，温度40℃。过滤，取5mL溶液以10mL/min的流速通过预活化好的Sep-pak-C18固相萃取小柱，弃去最初的2mL，收集后面的3mL，再用0.45μm的水系滤膜过滤，滤液供分析用。

3 结果与讨论
3.1 流动相的选择
考察不同比例的乙腈或甲醇水溶液（100、90、80、70和60%）作为流动相的情况，发现乙腈在流动相中比例增大，可有效改善色谱峰形，有利于各组分的基线分离，但有机相比例增加不利于糖的溶解，分析时间也显著延长。当增加流动相中水的比例时，分析时间变短。但水的比例过大，组分峰相互靠近，阿拉伯糖与果糖、甘露糖与葡萄糖不能实现基线分离；同时，也不利于流动相在漂移管内的汽化，使基线噪声增大，从而导致分析灵敏度的降低。综合考虑分离效果、分析时间等因素，本文选择乙腈-水（70：30，V/V）的体系作为流动相。

3.2 ELSD参数的选择
漂移管温度和载气流速是ELSD检测器的两个重要参数[11]。漂移管温度影响检测器的响应，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比上升，但温度过高，可能导致组分部分汽化，信号响应值变小。雾化载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应。信噪比随流速的增加而升高。本文选择漂移管温度为80℃，氮气作载气，流速2.00L/min，可达到最小的噪声信号，色谱图基线平稳。
3.3 线性范围与检出限
将浓度为40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L、1200 mg/L、1600 mg/L、2000 mg/L的各系列标准糖溶液，在测定条件下进样10μL，对应糖的绝对量为0.4μg、0.8μg、1.2μg、1.6μg、2.0μg、4.0μg、8.0μg、12.0μg、16.0μg、20.0μg。根据ELSD测得的峰面积A（单位：mV.S）对应糖的绝对进样量C（单位：μg）进行线性回归，得到曲线方程。再将最小质量浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样10μL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的质量浓度以确定检出限，结果见表1。
3.4 样品预处理
实验采用超声波辅助、水浸提的方法提取烟草样品中的水溶性糖，升高温度有利于糖的快速溶出，但温度超过60℃会加快多糖、蔗糖和麦芽糖的水解，本文选择浸提温度为40℃。在该温度下超声浸提30 min以上可使糖完全溶出，故实验选择浸提时间为40 min。糖提取液最好当天测定，以减少多糖和二糖水解对测量结果的影响。采用经甲醇和水活化处理后的Sep-pak-C18固相萃取小柱以及测糖预柱可去除样品溶液中的醛、酮、内酯、有机酸等杂质[12]，有效保护分析柱并延长其使用寿命。经小柱净化后的样品液，用0.45μm的水系滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC分析。
3.6 结论
采用高效糖分析柱、乙腈和水作流动相、蒸发光散射检测器，建立了烟草中8种水溶性单糖和二糖的同时测定方法。方法准确可靠，重现性好，回收率满意，检出限较低，可用于烟草及其制品中糖含量的质量分析与控制，具有实用价值。