高效液相色谱法监测肾移植患者环孢素A的全血浓度

环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一种强有力的免疫抑制剂，目前已广泛应用于器官移植术后的抗排异反应［1］。由于其血药浓度与疗效和毒副作用密切相关，而且个体差异大，因此血药浓度监测对维护病人的最佳免疫抑制水平至关重要［2］。目前测定CsA血药浓度的方法有RIA法、FPIA法和HPLC法等，前两法易受代谢物影响而发生交叉反应［3］。我们用HPLC法对器官移植病人术后CsA的全血浓度进行监测，并对色谱条件、提取方法等进行了研究和改进，使其能较好满足临床的需要。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂：日本岛津系列LC-6A高效液相色谱仪，包括SPD-6AV检测器，SCL-6B系统控制器和C-R4A色谱数据处理仪。环孢素A标准品和环孢素D标准品均由Sandoz公司提供。　　
CsA贮备液：精密称取CsA标准品10 mg,置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。内标溶液：精密称取CsD 1 mg,置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1 ml上述溶液，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。贮备液与内标液均置冰箱保存。　　
甲醇、叔丁基甲醚、正己烷等均为分析纯。1.2　色谱条件：色谱柱为Shim-pack CLC-C8柱(150 mm×6 mm,10 μm)；流动相为甲醇∶水(80∶20，V/V)；流速1.5 ml/min；检测波长210 nm；柱温70℃。
1.3　血样处理和测定方法：取全血0.5 ml，加入内标溶液12μl及0.1 mol/L盐酸溶液2 ml，旋涡混合30 s后加入叔丁基甲醚5 ml混合提取3 min，于3000 r/min离心10 min，吸取上层液于另一试管中，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，旋涡振荡30 s，于3000 r/min离心10 min，吸取上层液于60℃以下水浴分两次氮气吹干，提取物用100 μl正己烷和60 μl质量浓度为1%的硫酸铵溶液充分溶解后取下层液20 μl进样。以CsA和内标峰高比R=HA/HD(HA为CsA峰高，HD为内标峰高)为定量计算依据，计算全血中CsA的含量。
2　结果
2.1　色谱行为与色谱峰定性：在上述色谱条件下，色谱分离情况见图1、2，环孢素A保留时间为8.8 min，内标环孢素D保留时间为10.3 min。可见血中杂质对CsA的分离无干扰，并且内标与CsA可完全分离。 图1　标准血样色谱图1 环孢素A　2 内标环孢素D 图2　样品血样色谱图1 环孢素A　2 内标环孢素D
2.2　线性关系及检测限：取空白血0。5ml，分别加入一定量的CsA贮备液，使浓度分别为50、100、200、320、480、720、10002μg/L，按血样处理和测定方法测定，以峰高比对备药浓度作回归分析，回归议程为Y=6.396 10-3X+0.4032（r=0.9993，n=7），可见全血CsA浓度在50～1000 μg/L范围内线性关系良好。最低检测浓度为10 μg/L。
2.3　方法回收率及精密度：配制CsA浓度分别为100、320、720 μg/L的标准血样，经预处理后进行日内、日间精密度测定，结果见表1。表1　方法回收率及精密度
　 加入量(ρB/μg.L-1) 测得量(ρB/μg.L-1) 回收率(%) RSD(%)
日内 100 109.06±4.967 109.1±4.9 4.6
(n=5) 320 333.18±24.35 104.1±7.6 7.3
　 720 718.15±56.62 99.7±7.9 7.9
日间 100 108.30±6.642 108.36±6.6 6.1
(n=5) 320 300.90±21.08 94.0±6.6 7.0
　 720 687.31±33.18 95.5±4.6 4.8
2.4　干扰实验：在上述色谱条件下，苯巴比妥、卡马西平、丝裂霉素、尼莫地平、尼群地平、硝苯地平、心律平、茶碱、硝西泮、阿普唑仑、氯硝安定、地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、安眠酮、 甲氨蝶呤、地尔硫卓18种药物对测定无干扰。
3　讨论
3.1　目前国内外测定全血中CsA的方法主要有荧光偏振免疫测定法(FPIA)和HPLC法。虽然FPIA检测灵敏度较高，但其检测特异性及准确性差，实际应用中采用HPLC较多［4］。全血样品的处理方法，一般需经液-液萃取并结合固相富集或经多次萃取，操作繁琐、试剂复杂，本法利用强酸、强碱去除大部分内源性杂质，再经正己烷进一步除去干扰物后进样，简化了操作， 结果准确，回收率高，精密度良好。
3.2　文献报道的流动相以三元、四元流动相体系为多［3～5］，且用毒性大的乙腈或对色谱柱有损害的缓冲液。本法仅采用甲醇∶水(80∶20，V/V)为流动相，更为简单经济，毒性小，且取得很好的效果，样品峰与内标峰分离效果好，峰型尖窄对称，保留时间适宜，最低检测浓度优于所有国内文献报道方法。
3.3　检测波长的选择，文献报道不一，我们观察了λ=214，212，210，208，204 nm时对测定的影响，综合分离度、杂质干扰等因素，采用210 nm为检测波长。