高效液相色谱法测定葡萄酒中苯甲酸和山梨酸

【核心介绍】发展了一种高效液相色谱法测定葡萄酒中苯甲酸和山梨酸含量的方法。采用反相 C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d., 5μm)，以甲醇/0.02mol/L乙酸铵(5/95,V/V）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长230nm，柱温为40℃。实验结果表明：苯甲酸和山梨酸在5.0～100.00mg/L浓度范围内线性相关系数分别为0.9999和1.0，方法检出限分别为0.34mg/L和0.43mg/L (S/N=3)，平行5份葡萄酒样品，苯甲酸和山梨酸含量相对标准偏差分别为2.13%和0.21%； 　

高效液相色谱法测定葡萄酒中苯甲酸和山梨酸

王丰琳¹，赵连海¹，于淑新¹，孙元社¹，唐涛^1，2，李彤^1*

（1. 大连依利特分析仪器有限公司，辽宁 大连 116023；2. 南京理工大学，江苏 南京 210094)

    摘要  发展了一种高效液相色谱法测定葡萄酒中苯甲酸和山梨酸含量的方法。采用反相 C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d., 5μm)，以甲醇/0.02mol/L乙酸铵(5/95,V/V）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长230nm，柱温为40℃。实验结果表明：苯甲酸和山梨酸在5.0～100.00mg/L浓度范围内线性相关系数分别为0.9999和1.0，方法检出限分别为0.34mg/L和0.43mg/L (S/N=3)，平行5份葡萄酒样品，苯甲酸和山梨酸含量相对标准偏差分别为2.13%和0.21%；加标浓度分别为100mg/L和250mg/L，苯甲酸和山梨酸加标回收率分别为103.90%～108.90%和96.1%～103.9%。该方法定量结果准确，能够满足葡萄酒中苯甲酸和山梨酸含量测定的要求。

    关键词  苯甲酸；山梨酸；葡萄酒；高效液相色谱法

    中图分类号  O657.7⁺2                              

 

Determination of Benzoic Acid and Sorbic Acid in Grape Wine

 by High Performance Liquid Chromatography

WANG Fenglin¹，ZHAO Lianhai¹，YU Shuxin¹，SUN Yuanshe¹，TANG Tao^1，2，LI Tong^1*

（1.Dalian Elite Analytical Instruments Co.，Ltd.，Dalian 116023，China；2. Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, China)

    Abstract  In this paper, a method for determination of benzoic acid and sorbic acid in grape wine by high performance liquid chromatography（HPLC）was developed. The separation was performed by C18 column (250mm×4.6mm i.d., 5μm) with gradient elution of methanol/ 0.02mol/L ammonium acetate (5:95,v:v) at 40℃. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 230 nm. The results of benzoic acid and sorbic acid showed that the linear range was from 5.0 to 100.0 mg/L with a linear correlation coefficient of 0.9999 and 1.0, respectively. The limit of quantification was 0.34 mg/L and 0.43 mg/L in grape wine sample (S/N=3). The relative standard deviations of parallel determination (n=5) were 2.13% and 0.21%. The recoveries were 103.90%～108.90% and 96.1%～103.9% of 100.0 mg/L and 250.0 mg/L in grape wine. It was indicated that the method was accurate and repeatable for the determination of benzoic acid and sorbic acid in grape wine.

    Key words  benzoic acid; sorbic acid; grape wine; high performance liquid chromatography

 

葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿成的酒精饮料，是目前世界上产量最大、普及最广的单糖酿造酒。葡萄酒中含有一定的糖分，因此工艺条件控制不当或储存不当时，会导致葡萄酒变质。山梨酸、苯甲酸作为常见的防腐剂，在国内是允许添加到葡萄酒中的。国家标准“GB15037-2006葡萄酒”中规定苯甲酸最大允许量为50mg/L，山梨酸最大允许量为200mg/L。媒体也有报道，某些葡萄酒产品中苯甲酸和山梨酸含量超标。人体长期过量摄入苯甲酸和山梨酸会对肝脏和肾脏产生毒性，因此有必要建立简单有效的葡萄酒中苯甲酸和山梨酸的检测方法。目前，葡萄酒中苯甲酸和山梨酸检测方法以高效液相色谱法为主^[1-6]，前处理方法多采用乙腈沉淀蛋白，加热去除乙醇或固相萃取去除杂质等方法，前处理设备相对复杂，耗时较长。

本文发展了一种葡萄酒中苯甲酸和山梨酸检测的反相高效液相色谱法，前处理方法简单，葡萄酒样品稀释后，调节pH值后，即可直接进样分析。该法检出限低，回收率高，定量结果准确，具有良好重复性，能够满足葡萄酒中测定苯甲酸和山梨酸的要求。

1  实验部分

1.1  仪器与试剂

高效液相色谱仪（D5101紫外-可见检测器，P5102二元高压恒流泵，S5101自动进样器，O5101色谱柱恒温箱，W5100色谱数据工作站，上述仪器均为大连依利特分析仪器有限公司产品），涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-861），pH计（梅特勒托利多）等。

苯甲酸标准品（百灵威科技有限公司，纯度＞98%），山梨酸标准品(百灵威科技有限公司，纯度＞98%)，甲醇（色谱纯），乙酸铵（分析纯），氨水（分析纯），去离子水等，葡萄酒加标样品（中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供）。

1.2  主要试剂配制方法

苯甲酸标准储备液：准确称取苯甲酸标准品0.05g于50mL容量瓶中，加乙醇溶解，并定容。

山梨酸标准储备液：准确称取山梨酸标准品0.05g于50mL棕色容量瓶中，加乙醇溶解，并定容。

苯甲酸/山梨酸标准工作液：分别取一定体积标准储备液，用流动相稀释至所需浓度。

1.3  样品前处理

准确量取葡萄酒样品10mL，加水10mL，混匀，氨水调节pH值至中性，转移至50mL容量瓶中，加水稀释并定容，摇匀，0.45µm滤膜过滤，进样分析。

1.4  色谱条件

流动相：A甲醇，B为0.02mol/L乙酸铵，A/B=5:95（V:V）。色谱柱：SinoChrom ODS-BP，5μm，4.6mm×250mm（大连依利特分析仪器有限公司），柱温40℃；进样量为10μL。

2  结果与讨论

2.1  苯甲酸和山梨酸标准品分析结果

按1.4色谱条件分析苯甲酸和山梨酸标准品，分离谱图如图1所示。

图1  10mg/L苯甲酸和山梨酸混合标准溶液色谱图

1.苯甲酸，2.山梨酸

    苯甲酸和山梨酸标准品分析保留时间分别为12.10 min和17.35min，拖尾因子分别为0.91和0.90，分离良好，峰形对称。

2.2  线性范围和检出限

配制浓度分别为5.0mg/L、10.0mg/L、25.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L、80.0mg/L、100.0mg/L的苯甲酸和山梨酸混合标准工作液，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，苯甲酸标准溶液浓度—峰面积线性曲线为y=34.732x+8.2126，线性相关系数为0.9999，山梨酸标准溶液浓度—峰面积线性曲线为y=59.451x+11.710，线性相关系数为1.0，说明苯甲酸和山梨酸在5.0～100.0 mg/L测试浓度范围内具有良好的线性相关性。

以3倍信噪比为仪器检出限，10倍信噪比为仪器定量限。苯甲酸和山梨酸仪器/方法理论检出限、定量限结果如表1。

表1 苯甲酸和山梨酸仪器/方法理论检出限、定量限

 

2.3  方法精密度

同一份葡萄酒样品，平行处理5次，计算其中苯甲酸和山梨酸含量，结果如表2所示，RSD值分别为2.15%和0.21%，说明方法重现性良好。

表2  葡萄酒中苯甲酸和山梨酸分析重复性结果（n=5）

 

2.4  方法准确性

加标浓度为100.0 mg/L、250.0 mg/L，苯甲酸和山梨酸加标回收率分别为103.90%～108.90%和96.1%～103.9%，结果如表3、表4所示。

表3  苯甲酸方法准确性结果

 

表4  山梨酸方法准确性结果

 

3  结论

发展了一种葡萄酒中苯甲酸和山梨酸含量的液相色谱测定方法，并对该方法进行了系统验证。结果表明：

1）苯甲酸和山梨酸标准溶液在5.0～100.0mg/L范围内具有良好的线性相关性，线性相关系数均分别为0.9999和1.0；实际样品中，苯甲酸和山梨酸的方法定量限分别为1.12mg/L和1.42mg/L。

2）平行处理5份样品，苯甲酸和山梨酸测定结果相对标准偏差（RSD）分别为2.15%和0.21%；加标浓度分别为100mg/L和250mg/L，苯甲酸和山梨酸加标回收率分别为103.90%～108.90%和96.1%～103.9%。

该方法操作简便，定量结果准确，检测灵敏度高，能够满足葡萄酒中测定苯甲酸和山梨酸的定性和定量要求。

 

参考文献

[1]  田富饶，王旭强，叶旭炎，刘亚丽，高效液相色谱法检测红酒中的苯甲酸和山梨酸[J]，现代科学仪器，2011，（2）：99-101.

[2]  汤海青，顾晓俊，殷居易，欧昌荣，高效液相色谱法测定葡萄酒中苯甲酸含量的不确定度评定[J]，食品工业科技，2013，34（15）：295-297.

[3]  田富饶，王旭强，叶旭炎，刘亚丽，高效液相色谱法检测红酒中的苯甲酸和山梨酸[J]，中国乳品工业，2011，（2）：99-100.

[4]  段迎燕，武婷，高效液相色谱法同时测定葡萄酒中的乙酰磺胺酸钾、糖精钠、苯甲酸、山梨酸[J]，分析测试技术与仪器，2014，20（1）：31-36

[5]  常晶红，辛若竹，丁梅，宋晓宏，马淑欣，国标法测定葡萄酒及配制酒中山梨酸、苯甲酸、糖精钠含量的改进[J]，酿酒科技，2013，（5）：65-68

[6]  杨华梅，葡萄酒中苯甲酸和山梨酸含蛋测定方法的研究[J]，中国酿造，2008，（19）：85-89.