SPE-UPLC-MS/MS法测定生鲜乳中舒巴坦残留

【核心介绍】本试验应用固相萃取技术（SPE），结合超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，建立了快速测定生鲜乳中舒巴坦残留量的方法。生鲜乳样品经乙腈提取，Oaiss PRiME HLB固相萃取小柱净化后，以50%乙腈水溶液为流动相，Waters Hilic色谱柱进行分离；多反应监测模式，外标法进行定量。结果发现：方法回收率在73.8%～93.5%之间；相对标准偏差（n=3）范围为1.5%～5.3%；线性范围为0.1～1.0mg/L；舒巴坦检出限为1.5×10-2mg/kg。表明该方法专属性强、灵敏度高 　

SPE-UPLC-MS/MS法测定生鲜乳中舒巴坦残留

孙涛，陈贺，宋斌，赵子刚，古丽斯坦，刘圣红，安静，王成*

（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐）/新疆农产品质量安全实验室 新疆 乌鲁木齐 830091）

摘 要 本试验应用固相萃取技术（SPE），结合超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，建立了快速测定生鲜乳中舒巴坦残留量的方法。生鲜乳样品经乙腈提取，Oaiss PRiME HLB固相萃取小柱净化后，以50%乙腈水溶液为流动相，Waters Hilic色谱柱进行分离；多反应监测模式，外标法进行定量。结果发现：方法回收率在73.8%～93.5%之间；相对标准偏差（n=3）范围为1.5%～5.3%；线性范围为0.1～1.0mg/L；舒巴坦检出限为1.5×10^-2mg/kg。表明该方法专属性强、灵敏度高，适用于生鲜乳中舒巴坦残留量的测定。

关键词 固相萃取；超高效液相色谱-串联质谱；生鲜乳； 舒巴坦

中图分类号 O657.63

Determination of Sulactam Residues in Milk by SPE-UPLC-MS/MS

Sun Tao, Chen He, Song Bin, Zhao Zigang, GULisitan, Liu Shenghong, An Jing, Wang Cheng

(Institute of Quality Standards &Testing Technology for Agro-Products, XinJiang Academy of Agricultural Science, Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-Products(Urumqi), Key Laboratory of agro-products quality and safety of Xinjiang , XinJiang Urumqi 830091)

Abstract:This paper developed a SPE-UPLC-MS/MS method for the determination of sulactam residues in milk. Sulactam was extracted with acetonitrile, and cleaned up with PRiME HLB cartridge. The UPLC analyses was performed on an Acquity UPLC Hilic column with gradient elution using acetonitrile and water(50:50) as mobile phase. The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring(MRM) in electrospray negative ionization mode. Resulting in the average recoveries of sulactam ranged from 73.8% to 93.5%, with the relative standard deviation from 1.5% to 5.3%, the calibration curve was liner from 0.01 to 1.0mg/L, the detection limits of sulactam was 15 μg/kg and the limit of quantitation was 50 μg/kg. The results showed that this method had specific, sensitive and suitable for determination on sulactam in the milk.

Key words: SPE; UPLC-MS/MS; Milk; Sulactam

乳制品作为人类膳食结构中动物蛋白质的主要来源之一，对提高生活质量和均衡人类膳食结构具有重要作用。随着人民生活水平的不断提高，乳及乳制品已成为人们生活 中不可缺少的食品之一，生鲜乳的质量是保证乳制品质量的前提。我国农业行业标准 《无公害食品 生鲜牛乳》中明确规定生鲜乳中不得检出抗生素，极少数不法分子为逃避牛奶中抗生素的检测，在牛奶中非法加入β-内酰胺酶，使β-内酰胺类抗生素（如青霉素）降解，掩盖抗生素超标的事实。舒巴坦能与β-内酰胺酶结合，降低牛奶中酶的含量，影响正常的分析测定；添加这些非食用物质降低了生鲜乳的质量安全水平，危害了消费者的健康^[1]。

舒巴坦是一种不可逆的竞争性β-内酰胺酶抑制剂，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生产的绝大多数β-内酰胺酶都有较强的抑制作用^[2]。检测舒巴坦的方法主要有分光光度法^[3]，液相色谱法（HPLC）^[4]，液相色谱-质谱法(HPLC-MS)^{[2, 5, 6]}等。本试验研究了生鲜乳中舒巴坦前处理方法和UPLC-MS/MS检测条件。结果表明，本方法简便、快速、高效，能提高生鲜乳中舒巴坦检测的工作效率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XEVO-TQ三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司），配有电喷雾离子源（ESI）。Milli-Q超纯水设备（美国Millipore公司）；漩涡混合器（德国IKA公司）；CT18RT离心机(天美公司) ；PRiMe HLB小柱(3CC,60mg,美国Waters公司) ；微孔滤膜0.20µm(美国Pall公司)。

乙腈、甲醇等均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。水为超纯水。

1.2 标准工作液的配制

将舒巴坦标准品(纯度≥99.0，德国Dr.Ehrenstorfer公司)用50%乙腈水溶液配制成质量浓度为100mg/L的标准储备液，依据需要稀释成适当质量浓度的标准工作液，于4℃下保存。

1.3 色谱条件

色谱柱：Acquity Hilic（2.1mm×50mm，1.7μm）。柱温：40℃，样品室温度：10℃；进样量：5μL; 流动相：溶剂为乙腈：水=50+50；流速：0.20mL/min。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾负离子源（ESI-）；毛细管电压：2.50kV；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：650L/h。碰撞气：氩气，流量：0.18mL/min,驻留时间100ms，多反应监测扫描模式（MRM）。质谱参数见表1。

表1 多反应监测扫描模式(MRM)的部分质谱参数

Table 1 MRM conditions for determining components

组分	定性离子对 m/z	定量离子对 m/z	锥孔电压 CP(V)	碰撞气能量CE(eV)	保留时间 RT(min)
舒巴坦	232.1>140.0 232.1>188.1	232.1>188.1	15	20 10	0.81

1.5 样品采集

由市场、超市购买生鲜乳样品，混合均匀后，冷藏保存。

1.6 样品处理

准确称取1g（0.001 g）混匀后的样品于25mL具塞离心管中，加入3mL乙腈，涡旋混匀1min，10000r/min离心3min，取上清液于5mL玻璃试管，再向25mL具塞离心管中加入1 mL乙腈，漩涡混匀后，离心，上清液合并于5mL玻璃试管中，直接过PRiMe HLB固相萃取柱，收集滤出液，35℃氮吹至约0.5mL，用水定容至1mL，过0.20μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS 分析。

2 结果

2.1 质谱条件的优化

采用蠕动泵自动进样方式，以10µL/min速度将1.0µg/mL舒巴坦标准溶液注入三重四级杆质谱，采用负离子扫描方式进行质谱分析，在选定的ESI(-)模式下，舒巴坦产生稳定的强峰母离子m/z232.1。再打开碰撞气氩气，通过优化碰撞能量等参数得到舒巴坦的子离子，扫描出稳定强峰子离子m/z188.1、m/z140和m/z63.9，通过比较响应信号的强弱，选择m/z188.1、m/z140作为多反应监测子离子。对锥孔电压、碰撞气能量、离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流量等参数进行了优化，优化后的质谱条件见1.4。

2.2 色谱条件的选择

舒巴坦极性较强，在反相色谱柱上保留弱。崔向云等^[6]比较了Acquity BEH C₁₈、BEH C₁₈和CSH C₁₈三种色谱柱。薛霞等^[2]比较了C₁₈柱和Hilic柱(亲水色谱柱)后发现，Hilic柱可为强极性化合物提供适当保留。本文比较了Waters公司的超高效液相色谱柱Acquity HSST₃（2.1mm×50mm,1.8μm）、Acquity C₁₈（2.1mm×50mm,1.7μm）和Acquity Hilic（2.1mm×50mm,1.7μm）3种色谱柱，有机相采用乙腈和水。结果发现，采用上述三种色谱柱时舒巴坦均未有很好的保留，色谱图见图1。舒巴坦在HSST₃、C₁₈和Hilic柱上保留时间依次为0.59、0.72和0.81min。从色谱峰上看，采用C₁₈柱时，峰结束时有拖尾，峰形较差；从稳定性上看，采用HSST₃柱时舒巴坦出峰时间不稳定；采用Hilic柱时，舒巴坦的保留时间和峰形都比较好，所以最终选择Hilic柱进行分析。图2为舒巴坦多反应监测（MRM）色谱图。

图 1  3种色谱柱上舒巴坦色谱图

图 2 舒巴坦多反应监测（MRM）色谱图

2.3 前处理条件的选择

生鲜乳品中药物残留提取试剂通常有乙腈、甲醇、丙酮。郑小严等^[5]发现甲醇与奶液体积比为5:1，丙酮与奶液体积比为3:2时，奶液中蛋白沉淀效果较好；本试验选取乙腈与奶液体积比为3:1进行提取，不仅蛋白沉淀效果好，而且提取液中干扰物少。在SPE小柱的选择上，薛霞等^[2]选取HLB柱，郑小严等^[5]选取PWAX柱净化，以上两种固相萃取小柱用前均需活化，上样后均需淋洗和洗脱的步骤；本试验应用PRiMe HLB固相萃取柱，无需活化、淋洗和洗脱的步骤，采取直接过滤净化的方式，提高了样品前处理的速度。

2.4 线性关系、方法准确度及精密度、检出限及定量限

2.4.1 线性关系

选取空白样本提取液配制系列基质标准工作溶液0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L，绘制标准曲线进行定量，线性关系和相关系数：

舒巴坦 y=20.081x+2.159，r=0.9970。

2.4.2 方法准确度及精密度、检出限及定量限

对舒巴坦分别按0.10、0.50、1.00mg/kg添加水平对生鲜乳进行了加标回收试验，得到了较好的结果，回收率及其相对标准偏差RSD(n=3)见表3。在三个添加水平，平均回收率在73.8%～93.5%，RSD≤5.3%；以添加标准样品0.10mg/kg时按3倍信噪比计算方法检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ）。

表 2  舒巴坦添加回收率、LOD与LOQ

目标物	添加浓度 (mg/kg)	回收率 recovery/%			RSD /%	LOD µg/kg	LOQ µg/kg
舒巴坦	0.10 0.50 1.00	82.0 90.8 93.1	78.0 88.5 90.9	73.8 83.5 93.5	5.3 4.3 1.5	15	50

2.5 结论

试验选取生鲜乳作为测试样品，SPE法净化结合液相色谱串联质谱法；采用电喷雾离子源（ESI-），Acquity HSST₃超高效液相色谱柱对生鲜乳中舒巴坦进行分离；建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定生鲜乳中舒巴坦残留的分析方法，该方法简便、快速、灵敏，测定结果满足生鲜乳中舒巴坦残留的检测要求。

参考文献

[1] 王加启. 我国生鲜乳质量安全监管成效及发展对策. 农产品质量安全, 2010 (3):.12-15.

[2] 薛霞, 王骏, 刘桂亮, 等. 亲水作用色谱-串联四级杆质谱测定液态奶中舒巴坦. 分析测试学报, 2012, 31(6): 700-704.

[3] 全红, 白小红, 杜江, 等. 分光光度法测定注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠药物含量. 山西医科大学学报, 2003,34(6): 573-574.

[4] 刘珊珊, 单艺, 满朝新, 等. 高效液相色谱-二极管阵列检测法测定原料乳中的舒巴坦. 食品工业科技,2012,33(16): 64-66.

[5] 郑小严, 林钦, 游飞明, 等. 超高效液相色谱-串联四级杆质谱法同时检测乳品中β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸钾、他唑巴坦和舒巴坦的残留量. 分析试验室, 2013, 32(10):.47-51.

[6] 崔向云, 常建军, 张雪峰, 等. UPLC-MS/MS法测定液态乳中舒巴坦残留. 中国乳品工业, 2014, 42(10):.42-44.