全自动电位滴定法测定草莓维生素C及其稳定性的研究

【核心介绍】建立全自动电位滴定法测定草莓中维生素C，探讨影响草莓维生素C测定稳定性的因素，为草莓维生素C测定准确性提供依据。利用全自动电位滴定仪复合铂环电极的氧化还原滴定功能，用2-6二氯靛酚碱性染料对草莓VC提取液进行滴定，并用正交试验研究了光照、空气和温度对草莓VC测定稳定性的影响。全自动电位滴定法测定维生素C在0.1mg~2.0mg范围内其质量和滴定体积有很好的线性相关，相关系数为0.9996，回收率为94.29%~95.48%，相对标准偏差为0.28%。草莓维生素C提取液贮存24h，光照损失2.8%，温度损失 　

全自动电位滴定法测定草莓维生素C及其稳定性的研究

李静 聂继云* 闫震 李志霞

(中国农业科学院果树研究所/农业部果品质量安全风险评估实验室 辽宁兴城 125199)

摘要 建立全自动电位滴定法测定草莓中维生素C，探讨影响草莓维生素C测定稳定性的因素，为草莓维生素C测定准确性提供依据。利用全自动电位滴定仪复合铂环电极的氧化还原滴定功能，用2-6二氯靛酚碱性染料对草莓VC提取液进行滴定，并用正交试验研究了光照、空气和温度对草莓VC测定稳定性的影响。全自动电位滴定法测定维生素C在0.1mg~2.0mg范围内其质量和滴定体积有很好的线性相关，相关系数为0.9996，回收率为94.29%~95.48%，相对标准偏差为0.28%。草莓维生素C提取液贮存24h，光照损失2.8%，温度损失13.8%，但并不受空气的影响。全自动电位滴定法测定草莓维生素C不受颜色的影响，方法准确可靠，温度和光照是影响测定稳定性的关键因素。

关键词 草莓；维生素C；全自动电位滴定法；稳定性

中图分类号 S663.9

Determination and Stabilization of Ascorbic Acid in Strawberry by Automatic Potentiometric Titration

Li Jing,Nie Jiyun*,Yan Zhen,Li Zhixia

（The Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Fruit, Ministry of Agriculture, Xingcheng, Liaoning 125199, China）

Abstract An automatic potentiometric titration method for the determination of ascorbic acid in strawberry fruit was established, in which some important factors (light, temperature, and oxygen in the air ) that might affect Vc stability were analyzed and evaluated through an orthoganal experimental design. The method has good linearity in the range of  0.1mg~2.0mg .The correlation coefficient of 2,6-dichlor-indophenol titrtation volumes and Vc qualities was 0.9996. The spiking recoveries of method were 94.29%～95.48%, relative deviation of the method was 0.28%. The losses of ascorbic acid at light for 24h was 2.8%, the losses of ascorbic acid at 35℃ for 24h was13.8%, the less of air treatment was little. The results indicated that it is accuracy and reliability of determinatin of VC in strawberry fruit by automatic potentiometric titration. The method are used with colored solutions. Light and temperature are crucial factors to stabilization of Vc during its extraction and determination.

Key words Strawberry; Ascorbic acid; Automatic potentiometric titration; Stabilization

维生素C又称抗坏血酸，是维持人体正常生理功能的重要维生素之一^[1~4]，人体不能合成，需要通过食物获取^[1]。草莓中含有丰富的维生素C，维生素C含量是其营养价值重要评价指标之一^[5~10]，因此，建立草莓中维生素C的准确测定方法非常重要。由于维生素C的性质非常活跃，尤其是在液体状态时,非常不稳定，易受空气、热、光、pH等因素影响^[9~17],因此，如何降低提取液中维生素C的损失，提高检测效率一直是维生素C准确测定关键^[17-18]。目前，对影响草莓维生素C测定稳定性的研究主要集中在提取试剂的pH上^[18]，已报道的研究表明，酸性提取剂有利于稳定维生素C，Ponting对常用的草酸、偏磷酸和水等14种提取剂提取维生素C的稳定性进行了系统的研究，发现低浓度的草酸和偏磷酸水溶液配制的维生素C标准溶液相对较为稳定，室温放置24h，仅损失2.8%，其他酸性提取剂损失14.5%～86.2%不等，水损失最大，全部损失，草莓中的维生素C也是类似的规律，草酸和偏磷酸水溶液提取的维生素C相对其他的酸更稳定^[16]，因此，草酸和偏磷酸已作为水果和蔬菜中维生素C测定国家标准中使用的提取剂，如GB/T 6195^[19]。但未见有其他环境因子如温度、光照和空气对草莓维生素C测定稳定性的研究，对除pH以外其他环境条件对草莓维生素C测定稳定性的影响尚不明确。由于偏磷酸水溶液不稳定，本文选取草酸水溶液提取草莓中的维生素C，利用全自动电位滴定仪测定草莓中维生素C，使用正交试验系统研究酸性条件下，空气、温度和光照对草莓维生素C测定稳定性的影响，以明确维生素C检测的关键影响因子，减少草莓维生素C检测过程的损失，为草莓中维生素C的准确测定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

全自动电位滴定仪（瑞士万通公司905型），配置复合铂环金属电极，Tiamo工作站；组织捣碎机（美国WARING公司32BL80），离心机（日本日立公司R261）。

草酸（分析纯）、抗坏血酸（VC）（sigma公司，≥99%）、2,6-二氯靛酚钠盐（Sigma公司）、碳酸氢钠（分析纯）、水为蒸馏水。

草莓，市售，取可食部分混匀，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 草莓维生素C的提取

准确称取草莓样品200g，加入2%草酸200mL，组织捣碎机中匀浆，准确称取草莓匀浆20g，用1%草酸洗入100mL容量瓶中，定容，提取液混匀后9000r/min离心5min，上清液备用。

1.2.2 2,6-二氯靛酚溶液和VC标准溶液的配制

按照GB/T619中规定配制1mg/mL的标准VC溶液和2,6-二氯靛酚滴定染料。

1.2.3 全自动电位滴定法测定草莓中的维生素C

采用瑞士万通公司Tiamo工作站进行试验；传感器选择复合铂环金属电极；802螺旋搅拌器的搅拌速度选择9；滴定参数：信号漂移为20.0mV/min，最小加液量为5μL，最大加液量为50μL，加液速度为最大值；电位评估参数：等当点识别为5，等当点判定为最大，停止体积为50mL，停止等当点为3，到达等当点后加液体积为5mL。吸取1mg/mL的标准抗坏血酸溶液1mL，加入10 mL1%草酸和40 mL水于100 mL烧杯中，按照设定的滴定参数代替GB/T6195的手工滴定法滴定，计算其标准滴定度；同样的参数，吸取10 mL草莓维生素C上清液（1.2.1），加入40 mL水于100 mL烧杯中同样设定的条件滴定，计算草莓维生素C含量。

1.2.4 方法线性、精密度和回收率

配制0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.8mg/mL，1.0mg/mL，1.6mg/mL和2.0mg/mL的抗坏血酸标准溶液。用标定好的2,6二氯靛酚溶液按1.2.3进行滴定，记录滴定体积。以抗坏血酸的量为横坐标，消耗滴定液体积为纵坐标，建立校准曲线，计算校准系数。草莓样品按照1.2.3进行5次重复试验，计算精密度。草莓样品按照20mg/100g 和50mg/100g种浓度进行添加，每种浓度重复5次。分别计算2种不同添加浓度的回收率。

1.2.5 正交试验研究草莓维生素C稳定性

研究光照、空气和温度对等因素对草莓VC 1%草酸提取液测定稳定性的影响。采用L₁₂(3×2⁴)正交试验研究不同因素对VC提取液稳定性的影响，因素水平设计见表1。在此基础上，研究了VC提取液在室温避光（20℃±2℃）和冷藏避光（4℃±2℃）这两种常用的测定环境中的变化，分别测定0h、2h、4h、8h、24h、48h草莓VC含量。

表1 正交试验L₁₂（3×2⁴）因素水平表

水平	因素
	A（光照）	B（空气）	C（温度）
1	1（有光照）	1（有空气）	1（4℃）
2	2（无光照）	2（无空气）	2（20℃）
3			3（35℃）

1.2.6 数据分析

所有试验样品3次重复。用SAS 9.1软件处理正交试验数据。用正交试验极差分析法比较光照、空气和温度3种因素影响维生素C测定稳定性的大小，用正交试验方差分析法分析不同处理差异显著性分析。

2 结果和讨论

2.1 全自动电位滴定法测定草莓中维生素C

不论是使用2,6二氯靛酚溶液滴定1.0mg/mL 抗坏血酸标准溶液计算滴定度，还是使用2,6二氯靛酚溶液滴定草莓VC，全自动电位滴定仪的滴定终点的电位突跃很明显，电位滴定曲线的一阶导数曲线均有明显的峰值，终点判断准确，不受颜色的干扰，完全可用于草莓中VC的氧化还原滴定反应，见图1。

图1 VC滴定曲线及其一阶导数

----- 滴定电位曲线；——滴定曲线的一阶导数曲线；EP1最大值即等当点

（A）草莓VC提取液 （B）1.0mg/mL标准溶液

2.2 全自动电位滴定法测定草莓中维生素C的方法性能

2.2.1 方法的线性

VC标准溶液量在0.1mg～2.0mg的范围内，全自动电位滴定仪滴定体积与VC具有很好的线性，决定系数为0.9996，见图2。因此，在实际草莓样品测定中应保证其VC的量应控制在0.1mg～2.0mg之间。

2.2.2 方法的精密度和准确度

草莓样品中维生素C同时测定5个平行，样品平行测定结果具有非常高的精密度，即RSD值为0.82%，表2，样品间的变异度小，完全满足滴定法测定水果和蔬菜中维生素C的要求^[7]。方法的准确度用添加回收率表示，两种添加量回收率分别为95.50%和94.28%，表3，方法的可行性较高。

表2 方法的精密度试验

样品重复	1	2	3	4	5	平均值	RSD,%
含量，mg/100g	88.06	88.69	87.06	87.17	87.14	87.62	0.82

表3 草莓样品维生素C添加回收率

样品含量，mg/100g	添加量，mg/100g	测定值，mg/100g	回收率，%
87.62	20	106.72	95.50
	50	134.76	94.28

2.3 草莓维生素C提取液的稳定性

由于液体状态的维生素C具有较强的还原性,非常不稳定，易受空气、热、光、pH等因素影响，本试验使用正交试验研究了光照、空气和温度对草莓维生素C提取液稳定性的影响，从正交试验数据，表4和表5可知，温度对维生素C提取液稳定性影响最大，但在4℃和20℃条件下差异不显著，而35℃同4℃和20℃差异极显著，说明一般在室温（20℃±2℃）以下温度条件下，草莓维生素C提取液相对比较稳定，损失较少；而在35℃下无光照条件下，24h损失达11.69%，35℃下有光照条件下，24h损失高达13.8%。光照对草莓维生素C提取液的稳定性也有一定的影响，有光照和无光照2种条件下草莓VC提取液稳定性差异显著，如有光照，4℃条件，24h损失达2.8%，无光照，4℃条件，24h损失非常小。而有空气和无空气对维生素C提取液稳定性影响不显著。

在正交试验结果的基础上，选择4℃-避光和20℃-避光处理，详细研究草莓维生素C提取液的稳定性，发现在24h内，4℃和20℃避光条件下，草莓VC提取液比较稳定，损失较少，但到48h时，发现20℃避光条件，草莓VC提取液相对有所损失，损失了3.8%。而4℃避光条件下几乎未有损失，见图3。

图2 VC质量与滴定体积的线性关系 图3 不同处理草莓维生素C提取液稳定性

表4 草莓VC提取液稳定性正交试验结果L₁₂(3×2⁴)

试验号	A（光照）	B（空气）	C（温度）	VC含量 （mg/100g）
1	1（有光照）	1（有空气）	1（4℃）	91.46
2	1	1	2（20℃）	91.77
3	1	1	3（35℃）	81.65
4	1	2（无空气）	3	80.92
5	1	2	1	91.71
6	1	2	2	91.76
7	2（无光照）	1	2	93.49
8	2	1	3	83.76
9	2	1	1	94.21
10	2	2	2	93.54
11	2	2	3	82.70
12	2	2	1	94.25
K1	88.16a	89.39a	92.91a
K2	90.32b	89.10a	92.64a
K3			82.19b
R	2.16	0.29	10.72
重要性	C＞A＞B

表5  草莓VC提取液稳定性正交试验方差分析

变异来源	平方和	自由度	F值	显著性
A	41.9040	1	134.78	* *
B	0.7569	1	2.43
C	896.6180	2	1441.89	* *
误差	0.2673	2	0.43

注： * 表示影响显著(P＜0.05)。* *表示影响极显著(P＜0.01)。

3 结论

建立了全自动电位滴定仪测定草莓中维生素C的方法，方法的精密度、准确度、线性范围、提取液的稳定性等方面完全符合GB/T 6195-1986的要求，同时避免了样品提取液颜色和浊度的影响，适用于2,6-二氯靛酚滴定法测定草莓红色水果中维生素C的测定，为拓宽2,6-二氯靛酚氧化还原电位滴定法测定深色水果中维生素C奠定了一定的方法基础。草莓中维生素C使用1%草酸提取后，相对比较稳定。在测定过程中，当环境温度控制在（20℃±2℃）以下，样品处理过程中使用避光器皿，草莓维生素C提取后，24h内测定，结果准确可靠。

参考文献

[1] 张科生. 维生素C发现之旅 [M]. 南京: 东南大学出版社, 2012

[2] 张上隆, 陈昆松. 果实品质形成与调控的分子生理 [M]. 北京: 中国农业出版社, 2007: 220-229

[3] 曾翔云. 维生素 C的生理功能与膳食保障 [J]. 中国食物与营养, 2005,4: 52-54

[4] 孔祥伟. Ce⁴⁺/Ce³⁺缓冲溶液流动注射电势检测法测定维生素C [J]. 现代科学仪器, 2003, 5: 53-55

[5] 王世宽, 高慧娟, 洪玉程, 谢仁有, 范军. 草莓果酒中Vc保存率的研究[J]. 四川理工学院学报(自然科学版), 2011, 24(10): 497-500

[6] 李品艾. 草莓采收期维生素C含量的测定[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(19): 8832, 8850

[7] 王梦泽, 薛少平, 王佳, 阎勤劳. 草莓浑浊汁维生素 C 降解动力学模型[J]. 农业工程学报, 2010, 26(3): 353-356

[8] 曹霞敏, 孙建霞, 廖小军, 胡小松. 加工方法对草莓中抗氧化活性物质与抗氧化活性的影响[J]. 食品工业科技, 2010, 31(9): 390-393, 397

[9] B.K. Tiwari, C.P. O’Donnell, A. Patras, N. Brunton, P.J. Cullen. Effect of ozone processing on anthocyanins and ascorbic acid degradation of strawberry juice[J]. Food Chemistry, 2009, 113 (4) : 1119–1126

[10] B.K. Tiwari, C.P. O’Donnell, A. Patras, N. Brunton, P.J. Cullen. Anthocyanin and Ascorbic Acid Degradation in Sonicated Strawberry Juice [J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2008, 56: 10071–10077

[11] Engin Demiray, Yahya Tulek, Yusuf Yilmaz. Degradation kinetics of lycopene, b-carotene and ascorbic acid in tomatoes during hot air drying [J]. Food Science and Technology, 2013, 50: 172-176

[12] Vicente Bosch, Antonio Cilla, Guadalupe García-Llatas, Victoria Gilabert, Rafael Boix,Amparo Alegría. Kinetics of ascorbic acid degradation in fruit-based infant foods during storage [J]. Journal of Food Engineering, 2013, 116(2): 298–303

[13] Hsin-Yun Hsu, Yi-Chin Tsai, Chi-Chang Fu, and James Swi-Bea Wu. Degradation of Ascorbic Acid in Ethanolic Solutions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60, 10696−10701

[14] Jian-Ping Yuan, Feng Chen. Degradation of Ascorbic Acid in Aqueous Solution[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998, 46: 5078−5082

[15] James H. Tatum, Philip Eugene Shaw, Robert E. Berry. Degradation Products from Ascorbic Acid[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1969, 17 (1): 38–40

[16] Hugh T. Freebain. Determination and Stabilization of Reduced Ascorbic Acid in Extracts from Plant Material[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(11): 1850–1851

[17] 高媛, 张丙秀, 高庆玉, 代志国, 张志昆. 草莓果实维生素Ｃ提取的影响因素研究[J]. 河南农业科学, 2013,42(4)：161-163，167

[18] 聂继云, 董雅凤, 巩文红. 果品维生素C含量测定中的几个问题[J]. 中国南方果树, 2001, 30(1): 53-54

[19] GB/T 6195-1986. 水果、蔬菜维生素 C 含量测定法（2， 6－二氯靛酚法）[S].