动物胶原蛋白中羟脯氨酸的快速测定

【核心介绍】本文建立了一种快速水解、比色法测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸的方法，考察了水解液浓度和体积、水解温度和时间对水解过程的影响。实验结果显示：本方法可以在15min内将动物胶原蛋白完全水解，所测得的羟脯氨酸含量与参照国标方法GB/T 9695.23-2008水解16h所得结果一致，RSD小于4%，加标回收率为95%-105%，因此，该方法可以较为快速准确地测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸的含量。 　

动物胶原蛋白中羟脯氨酸的快速测定

贾涛 李新丽 艾曼 赵厚民

（江苏省理化测试中心 江苏南京 210042）

摘要 本文建立了一种快速水解、比色法测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸的方法，考察了水解液浓度和体积、水解温度和时间对水解过程的影响。实验结果显示：本方法可以在15min内将动物胶原蛋白完全水解，所测得的羟脯氨酸含量与参照国标方法GB/T 9695.23-2008水解16h所得结果一致，RSD小于4%，加标回收率为95%-105%，因此，该方法可以较为快速准确地测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸的含量。

关键词 动物胶原蛋白；羟脯氨酸；快速水解

中国分类号 TH744.12

Rapid Determination of Hydroxyproline of Animal Collagen Protein

Jia Tao, Li Xinli,Ai Man,Zhao Houmin

(Physics & Chemistry Test Center of Jiangsu Province,Nanjing 210042,Jiangsu,China)

Abstract A rapid determination method of hydroxyproline of animal collagen protein by hydrolysis and colorimetric analysis was descripted in this paper, and the influence effects (such as the concentration and volume of hydrolyzate, temperature and time) were investigated. The results showed that: the hydrolysis time was reduced from 16 h to 15 min, and the results were identical to that of GB/T 9695.23-2008, with the RSD was less than 4% and the recovery ratios were between 95% and 105%. Therefore, this method can determine the concentration of hydroxyproline of animal collagen protein with high accuracy and rapidity.

Key words Animal collagen protein;Hydroxyproline;Rapid hydrolysis

羟脯氨酸(Hydroxypmline，HYP)为亚氨基酸之一，是胶原蛋白的组成成分，胶原蛋白是构成结缔组织的主要成分。研究表明羟脯氨酸作为动物胶原蛋白的特有成分而存在，其含量高达10%以上。基于这一点，可以利用检测样品水解后羟脯氨酸的含量来衡量动物胶原蛋白的含量。

羟脯氨酸含量的测定方法很多，如比色法^[1-2]、高效液相法^[3]以及氨基酸自动分析仪法^[4]，目前应用较为普遍的是比色法，其优势在于检测成本低、速度快。国标 GB/T 9695.23-2008 已将其作为测定肉与肉制品中的羟脯氨酸含量的标准方法^[1]。

由于比色法测量的速度比较快，所以样品的分析速度主要取决于样品的前处理时间，而国标GB/T 9695.23-2008虽然可以准确地测定羟脯氨酸的含量，但样品水解过程非常耗时，需要16h。本研究针对动物胶原蛋白样品，改进样品水解方法，缩短前处理时间，建立快速测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸含量的方法。

本文重点研究了硫酸体积、浓度、水解温度和时间对样品水解的影响。正交实验表明：动物胶原蛋白样品在7mL、9mol/L的硫酸条件下，置于140°C烘箱15min即可完全水解，且水解出的羟脯氨酸含量与国标方法（水解耗时16h）所得结果基本相同。通过对实验条件的改进，水解时间为15 min，极大地缩短了样品前处理时间，提高了检测速度，为快速准确鉴定出动物胶原蛋白中羟脯氨酸的含量提供了一种快速高效的方法。

1 实验部分

1.1仪器

BSA224S-CW 分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），Delta320 pH 酸度计（梅特勒-托利多仪器公司），UV-1801 紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），HH-6 数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），DHG-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)

1.2试剂和标准

（1）硫酸溶液：将浓硫酸浓（ρ=1.84g/mL）用蒸馏水分别稀释为浓度为6mol/L的硫酸溶液。

（2）缓冲溶液(pH=6.8)：分别准确称取26.0g一水柠檬酸，14.0g氢氧化钠，78.0g三水乙酸钠，用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL的正丙醇，用水定容。

（3）氯胺 T：准确称取1.41g三水•N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），加入100mL缓冲溶液溶解。临用前配置。

（4）显色剂：称取 10.0g对二甲基苯甲醛，用35mL高氯酸溶液[60%(质量分数)]溶解，缓慢加入65 mL异丙醇。临用前配置。

（5）羟脯氨酸标准储备液：称取50mg 4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶，用水溶解，加入一滴硫酸溶液(1.2.1)，用水定容。

（6）固体样品：鱼骨胶原蛋白、猪皮水解胶原蛋白等样品均购于市场。

（7）实验中所用的试剂均为优级纯，水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

称取0.05g左右动物胶原蛋白 ( 精确至0.0001g)于250mL锥形瓶中，加入7mL硫酸溶液（1.2.1），用表面皿盖住，于140℃干燥箱内恒温15min。趁热将水解产物转移至100mL容量瓶中，用10mL硫酸溶液（1.2.1）分三次洗涤锥形瓶，合并至上述容量瓶中,用水定容，摇匀。

1.3.2 羟脯氨酸的测定^[1]

准确移取一定体积的水解产物至50mL容量瓶中，定容后羟脯氨酸浓度在0.5μg/mL-2.5μg/mL之间，为待测液。移取4.0mL上述待测液于比色管中，加入2.0mL氯胺T溶液，混合后于室温条件下放置20±1min。取4.0mL水于10mL比色管中，与待测液同步实验（空白试验）。加入2.0mL显色剂，充分混匀后将比色管迅速放入60℃水浴中加热20min。取出比色管，用流动水冷却比色管至少3min，在室温下放置30min。用水做参比，于波长558nm处用分光光度计测定吸收值。扣除空白溶液的背景值，根据所得的标准曲线得出水解产物中羟脯氨酸的含量。

2结果与讨论

2.1标准曲线

配置标准曲线的浓度梯度分别为：0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL，用分光光度计测其吸光度，以扣除了空白的标准工作液的吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=0.2097X+0.0031，r=0.9999表明羟脯氨酸标准溶液在 0.5～2.5μg/mL浓度范围内，其浓度与吸光度之间具有良好的线性关系。

2.2方法条件的选择

准确称取0.05g左右动物胶原蛋白( 精确至0.001g)，按1.3.1水解法进行样品前处理，然

后用比色法检测羟脯氨酸的含量。主要考察了硫酸浓度A(3mol/L、6mol/L、9mol/L)、硫酸体积B（10mL、20mL、30mL）、烘箱温度C（140℃、150℃、160℃）、恒温时间D（10min、20min、30min）这四个因素，通过正交实验确定最佳条件，本实验选择L9(3⁴)正交表，结果见表1。

表1  动物胶原蛋白快速水解条件实验表及L9(3⁴)结果

序号	C（mol/L）	V（mL）	温度（℃）	时间（min）	HYP-含量（%）
1	3	10	140	10	0.19
2	3	20	150	20	0.93
3	3	30	160	30	2.39
4	6	10	150	30	9.48
5	6	20	160	10	2.55
6	6	30	140	20	1.86
7	9	10	160	20	9.61
8	9	20	140	30	9.10
9	9	30	150	10	0.98
平均值	1.17	6.43	3.72	1.24
平均值	4.63	4.19	3.80	4.13
平均值	6.56	1.74	4.85	6.99
极差	5.39	4.69	1.13	5.75

表1中L9(3⁴)实验结果表明，各因素对动物胶原蛋白水解效率的影响大小顺序是：D>A>B>C，而实验（4、7、8）说明在一定条件下20min动物胶原蛋白已经充分水解，同时硫酸体积B的三水平的平均值也表明硫酸体积对动物胶原蛋白快速水解影响较大，减小体积反而有利于水解速率，同时考虑到高浓度硫酸在高温条件下的危险性，继续优化实验条件硫酸浓度9mol/L、硫酸体积B1（5mL、7mL、10mL）、烘箱温度C1（130℃、140℃、150℃）、恒温时间D1（10min、15min、、20min、）稍微调整了三因素的三水平，其正交实验结果如表2所示。

表2 动物胶原蛋白快速水解条件优化实验表

序号	C（mol/L）	V（mL）	温度（℃）	时间（min）	HYP-含量（%）
1	9	5	130	10	8.04
2	9	7	140	15	10.14
3	9	10	150	20	10.32
4	9	5	140	20	10.58
5	9	7	150	10	10.25
6	9	10	130	15	5.37
7	9	5	150	15	10.70
8	9	7	130	20	10.18
9	9	10	140	10	6.31
平均值		9.77	7.86	8.20
平均值		10.19	9.01	8.74
平均值		7.33	10.42	10.36
极差		2.86	2.56	2.16

优化实验结果表明，在微调了三因素的三水平因素后，B1、C1、D1影响顺序差别不大，结合正交实验表及具体实验结果，确定本实验的最佳实验条件是7mL、9mol/L的硫酸在140℃干燥箱恒温15min。

2.3 仪器检出限及方法精密度

用空白溶液同时测定20次，取3倍的标准偏差所对应的浓度为仪器的检出限，结果为0.012μg/mL。

按照上述快速水解最佳实验条件分别对7份动物胶原蛋白样品进行水解和检测，测定结果如表3所示，快速水解方法具有良好的精密度，RSD小于4%。

表3 方法精密度

序号	1	2	3	4	5	6	7	平均值	RSD%
HYP-含量（%）	9.69	9.99	10.48	9.82	10.4	10.36	9.51	10.04	3.82

2.4 方法准确性

对三种胶原蛋白进行了加标回收试验。其加标回收率在95%-105%之间，平均加标回收率为99.0%。回收率数据见表4。并与国标方法GB/T 9695.23-2008进行了对比，结果见表5，可知两种方法得到的羟脯氨酸含量基本一致，相对偏差RSD%均小于5.0%，因此该方法可以准确测定胶原蛋白中羟脯氨酸的含量。

表4 羟脯氨酸的加标回收率

样品名称	本底值 mg	加标量 mg	测定值 mg	回收率（%）
鱼骨胶原蛋白1	5.128	5.000	9.932	96.1
	4.985	5.000	10.137	103.0
鱼骨胶原蛋白2	1.217	1.000	2.259	104.2
	1.102	1.000	2.077	97.5
猪皮胶原蛋白	6.501	6.500	12.853	97.7
	6.690	6.500	12.891	95.4

表5 快速水解方法与国标水解方法羟脯氨酸检测结果对比（n=5）

样品名称	HYP-含量（%）		相对偏差
	本方法	国标法
鱼骨胶原蛋白1	10.04	10.11	0.69
鱼骨胶原蛋白2	2.14	2.23	4.1
猪皮胶原蛋白	12.55	12.32	1.8

3 结论

近年来对于快速检测方法的研究和应用越来越受到分析工作者和相关职能机构的重视，特别是国家对食品保健品领域监管的加强，食品快检方法的研究和应用也在飞速发展。因此，本研究工作在当前国内食品安全快速发展的转型期具有重要意义。本文介绍的快速测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸含量的方法，将传统十几个小时的前处理时间缩短到15 min～ 20 min，大大缩短了检测周期，提高了工作效率，节约了检测成本。研究结果表明，该快速测试方法具有良好的精密度和准确度，可以快速准确地测定动物胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，在常规检测工作中值得推广和应用。

参考文献

[1] GB/T 9695.23-2008 肉与肉制品羟脯氨酸含量测定

[2] 李景红，杨再山，孟祥晨.比色法检测乳中掺加的动物胶原水解蛋白[J].中国乳品工业，2007，35(9)：50-521

[3] 金苏英，林笑容，赵志红，朱慧，施文蓉.高效液相色谱法测定奶粉及其他乳制品中的 L-羟脯氨酸[J].饮料工业，2009，12（7）：28-30

[4] 曾暖茜，王洪健，周兴起等.氨基酸自动分析仪对乳制品中羟脯氨酸的测定方法研究[J].现代食品科技，2008，24(7)：719-7211