有机气溶胶中甾醇类有机示踪化合物的测定

【核心介绍】本文采用超声提取-硅烷化预处理-气相色谱质谱的分析技术分析监测颗粒物中的甾醇类化合物(Sterols)，通过比较条件实验，确定用超声提取的方式以二氯甲烷为萃取溶剂，硅烷化反应条件为100.0μL硅烷化试剂，在50℃的温度下反应20min。GC-MS分析甾醇类化合物得到各化合物工作曲线的线性良好，相关系数均在0.99以上，最低检出限在0.17-0.35ng/m3之间，实际样品的加标回收率在89.65%-93.26%之间，相对标准偏差均低于6.23%。对实际样品的测定结果是β-谷甾醇的浓度是四种化合物中浓度最 　

有机气溶胶中甾醇类有机示踪化合物的测定

赵红帅 刘保献^* 赵起越 常淼

（北京市环境保护监测中心 北京 100048）   

摘要 本文采用超声提取-硅烷化预处理-气相色谱质谱的分析技术分析监测颗粒物中的甾醇类化合物(Sterols)，通过比较条件实验，确定用超声提取的方式以二氯甲烷为萃取溶剂，硅烷化反应条件为100.0μL硅烷化试剂，在50℃的温度下反应20min。GC-MS分析甾醇类化合物得到各化合物工作曲线的线性良好，相关系数均在0.99以上，最低检出限在0.17-0.35ng/m³之间，实际样品的加标回收率在89.65%-93.26%之间，相对标准偏差均低于6.23%。对实际样品的测定结果是β-谷甾醇的浓度是四种化合物中浓度最高的，胆固醇在不同区域中浓度相差不大，说明胆固醇有稳定的排放源，在餐饮源样品中发现甾醇类化合物的浓度均高于其他区域样品。本方法适合颗粒物样品的测定，并且可以推广到其他类型的颗粒物样品中，也为以后的源解析工作提供数据支持。

关键词 有机示踪化合物；甾醇类；气相色谱质谱

中图分类号 TH833   

              

Determination of Trace Organic Compounds Sterols in Organic Aerosol

Zhao Hongshuai,Liu Baoxian,Zhao Qiyue,Chang Miao

(Beijing Municipal Enviromental Monitoring Center,Beijing 100048,China)

Abstract This paper is about the analytical method of Sterols in atmospheric particulate matter by gas chromatography mass-spectrometry with ultrasonic extraction. By comparing the experimental conditions，Ultrasonic extraction was determined as pretreatment method, extraction solvent was dichloromethane, and derivatization reaction condition was 100.0μL derivatization reagent, reaction time was about 20 min at 50℃. After Analysed by GC-MS, every compound of sterols had good linearity, the correlation coefficient was above 0.99, the lowest detection limit was between 0.17~0.35 ng/m³,  the recovery of actual samples was between 89.65%~93.26%, and the relative standard deviation was less than 6.23%. Through the determination of actual samples, we found β-Phytosterol has highest content in four of sterols, cholesterol has same content in different areas, which showed it has stable emission source. Food source sample results showed the concentration of sterols was all higher than the other area particle samples. This method is suitable for detecting particulate matter samples, and can be extended to other types particulate matter samples.

Key words Organic molecular tracer; Sterols; Gas chromatography-mass spectrometry

有机气溶胶是大气气溶胶尤其是细颗粒物（PM_2.5）的重要组成部分，直接或者间接影响着大气环境质量、气候变化和人体健康，此外，细颗粒物的长距离传输将这些影响区域化，甚至全球化，使大气污染成为全球性问题。因此了解有机气溶胶中有机物的浓度及其组成有助于我们治理空气污染、改善人类居住环境以及应对全球气候变化等问题^[1]。甾醇类化合物(Sterols)在动物和植物中分布极其广泛，按其来源可分为动物甾醇和植物甾醇。胆固醇是动物甾醇的典型代表，它是类固醇的一种，是高等动物的生化作用的产物，几乎所有的身体组织中都含有胆固醇，尤其是动物的脂肪和油中，因此胆固醇被认为是烹调源的重要的有机示踪物。植物甾醇包括菜油甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇等，它们存在于所有高等植物中，能反应近代生物源的输入，其中β-谷甾醇的含量远远地大于其他植物甾醇，所以β-谷甾醇被认为是生物质燃烧的示踪物^[1-5]。虽然这类化合物在气溶胶中的绝对含量很低，但是它们对于气溶胶的示踪意义很重大，国外对于这类有机示踪物的研究已经开展多年^[6-12]，而国内的研究报道还很少^[13-15]，因此建立颗粒物中甾醇类化合物含量测定方法的需求很迫切，本研究采用超声提取-硅烷化预处理-气相色谱质谱的分析技术分析了颗粒物中的甾醇类化合物的含量，并且将为以后颗粒物的源解析工作提供必要的数据支持。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

GC7890-5975气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司)，KQ-700VDE型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），OA-SYS^TM氮吹仪（美国），TH-150型中流量颗粒物采样器（武汉天虹公司）。

甾醇类标准样品：胆固醇(Cholesterol，99%，Cambridge Isotope)；豆甾醇（Stigmasterol，98%，Toronto Research Chemicals）；β-谷甾醇（β-Phytosterol，98%，Chem Service）；菜油甾醇（Campesterol，98%，Shimadzu）；将此四种甾醇类标准样品准确称量，用正己烷溶解并逐级稀释，配成4混甾醇类化合物标准系列，于4℃冰箱中保存备用；正二十三烷-D₄₈（C₂₃D₄₈，98%，Aldrich，内标物）；正二十四烷-D₅₀（C₂₄D₅₀，98%，Aldrich，替代物）将替代物标准物质准确称量，正己烷溶解并逐级稀释，得到替代物标准系列，于4℃冰箱中保存备用；；N,O-双-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺（BSTFA，Regis）和三甲基氯硅烷（TMCS，Regis）99：1（硅烷化试剂）；石英滤膜(直径90 mm，美国Millipore公司，使用前在马弗炉中以500℃条件下烘烤4h)；二氯甲烷(dichloromethane，DCM)；正己烷(n-hexane，HEX)；甲醇（Methanol）均购于J.T.Baker。

1.2 工作曲线的绘制

准确量取100.0μL 4混甾醇类标准系列于2.0mL进样小瓶中，加入100.0μL硅烷化试剂使用液，密封进样小瓶，于50℃恒温箱中反应20min，冷却至室温，加入100.0μL内标使用液（93.0 mg/L），HEX定容至1.0mL，配制浓度为10.0、1.00、0.50、0.10、0.05mg/L的4混甾醇类化合物的工作曲线，上GC-MS测定，内标法定量，同时按照HJ/T168-2004^[16]的要求得到各化合物的最低检出限，结果见表1，可以看出各化合物工作曲线的线性良好，相关系数均在0.99以上，最低检出限在0.17-0.35ng/m³之间。

1.3 样品前处理

将采集到颗粒物的滤膜样品小心的放到100.0mL平底玻璃萃取瓶中，有颗粒物的一面朝上，准确加入100μL浓度为93mg/L的替代物（C₂₄D₅₀）标准溶液，待溶剂挥发近干之后，往萃取瓶中加入20.0mLDCM浸没滤膜。将提取瓶用铝箔密封后，放入超声振荡器振荡15min，萃取液经过滤后转移至浓缩瓶中，再重复萃取两次，合并所有萃取液，用氮吹仪浓缩至200.0μL以下，HEX换相并氮吹至200.0μL，转移到进样小瓶中，加入100.0μL衍生试剂，于50℃烘箱中，衍生20 min，待自然冷却至室温后，加入100.0μL内标使用液，HEX定容到1.0mL，上GC-MS测定，甾醇类化合物的浓度通过替代物的回收率来矫正计算。

1.4 气相色谱-质谱条件

进样口温度：280℃；流速：1.0mL/min；分流比：5：1程序升温：70℃（2min），以8℃/min上升到300℃保持10min；传输线温度：280℃；离子源：230℃；四级杆：150℃；电压：70eV；溶剂延迟：2.6min；由上述色谱条件得到的标准物质的色谱图和替代物标准物质的色谱如图1，化合物的其他质谱参数见表1。

图1 A：甾醇类化合物质谱图；B：替代物质谱图（序号参照表1）

Fig.1A: Mass chromatogram of sterols; B: Mass chromatogram of substitute(serial number refer to table 1)

表1 各化合物质谱参数、标准曲线和最低检出限

Tab.1 Compounds’ Mass spectrum parameters、standard curve and the Limit of detection

序号 No.	化合物名称 Compounds name	保留时间 Retention tine (min)	定性离子 Qualitative ions （m/z）	定量离子 Quantitative ions （m/z）	标准曲线 Standard curve	相关系数 correlation coefficient (R2)	浓度范围 concentration range (mg/L)	最低检出限 Limit of detection (ng/m3)
1	Cholesterol	32.752	130	73/330	y=0.2851x	0.998	0.05-10.0	0.17
2	Campesterol	34.002	129	343/382	y=0.337x	0.9983	0.05-10.0	0.35
3	Stigmasterol	34.326	129	83/255	y=0.2205x	0.9972	0.05-10.0	0.21
4	β-Phytosterol	35.177	129	357	y=0.2457x	0.9981	0.05-10.0	0.33
5	C24D50	25.363	66	50/82	y=1.3501x	0.9974	0.7-14.0
6	C23D48	24.310	66	50/82

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂和硅烷化条件选择

目前国外文献报道的颗粒物中羰基化合物的衍生化基本都采用BSTFA/TMCS（99：1）作为硅烷化试剂，硅烷化反应需要在绝对无水的环境下进行，很多文献推荐使用DCM和甲醇的混合溶液作为萃取溶剂^{[4-6，10-11]}，我们将DCM、DCM和甲醇的不同比例的混合溶液分别通过试验做了比较，结果发现甲醇的存在加剧了硅烷化试剂的消耗量，使得各化合物的回收率极度不稳定，本文最终选择了DCM作为萃取溶剂。

硅烷化试剂的加入量、反应温度和反应时间是影响硅烷化反应速度的三个重要参数，本实验选用100.0 mg/L的标准溶液，用2.2的操作方法，做了三组比较试验，第一组试验我们分别考察了加入50.0μL、100.0μL、150.0μL和200.0μL四种不同体积的硅烷化试剂，对反应结果的影响、第二组试验我们考察了在20℃、40℃、50℃、60℃和70℃五个不同反应温度下得到结果的差异，第三组试验我们分别比较了5min、10min、15min、20min和25min五个不同的时间段对反应的影响，三组试验得到的结果见图2，由图2可以看出，甾醇类化合物在常温下就可以与硅烷化试剂发生反应，考虑到实际样品中化合物的复杂多样性我们最终将硅烷化条件定为：100.0μL硅烷化试剂在50℃的温度下反应20min。

图2 硅烷化反应的条件实验

Fig.2 The conditions of derivatization reaction experiment

2.2 不同前处理方法的比较

超声提取是最常用的一种提取方式，但是它需占用操作人员很大的精力，快速溶剂萃取（ASE）由于其自动、快速、所需溶剂少而且萃取效率高得到了越来越多科研工作者的认可，本文对这两种方式做了比较，其中ASE的条件设定为萃取溶剂DCM、温度120℃、压力10.34MPa，自动循环3次。

取空白石英滤膜，准确加入100.0μL4混甾醇类标准样品（0.50mg/L和50.0mg/L），得到0.05mg/L和5.0mg/L两种不同浓度的加标滤膜样品，对上述两种前处理方法分别平行制备6个，加入一定量的替代物标准溶液，分别用超声提取和ASE两种前处理方式对颗粒物中的Sterols化合物进行提取，提取液经浓缩后上GC-MS测定，两种提取方式得到甾醇类化合物的平均加标回收率如表2所示，由表2可以看出对于替代物C₂₄D₅₀而言，其回收率为超声提取的82.9%优于ASE的64.12%，从目标化合物的结果看，两种提取方式对于高浓度的回收率结果差异不大，而低浓度平均回收率和RSD的结果为ASE143.4%-232.3%和5.48%%-7.48%和超声为58.78-75.31%和2.46%-6.26%，由此可以看出超声提取的稳定性更好一些，本文选择超声提取作为实验的前处理方式，

2.3 精密度和准确度试验

取空白石英滤膜，准确加入100.0μL4混甾醇类标准样品（0.50mg/L和50.0mg/L），得到0.05mg/L和5.0mg/L两种不同浓度的加标滤膜样品，分别平行制备6个，按照上述方法处理样品，得到甾醇类化合物的平均加标回收率如表2所示。

实际滤膜加标实验参照赵红帅等文献报道的操作^[17]，得到加标回收率结果见表2。实验得到替代物C₂₄D₅₀的平均回收率为82.9%，由表2可以看出空白滤膜的低浓度加标回收率在58.78%-75.31%之间，相对标准偏差低于6.26%，高浓度的加标回收率在94.60%-99.74%，相对标准偏差低于5%，而实际样品的加标回收率都在89.65%-93.26%之间，相对标准偏差均低于6.23%。

表2 精密度和准确度试验结果

Tab.2 The results of Precision and accuracy tests

化合物 compound	空白含量 Blank quartz membrane sterols concentration（mg/L）	ASE					超声提取					实际样品
		替代物平均回收率% average recovery of substituted（%）	低浓度平均回收率% average recovery of low content （%）	相对标准偏差RSD (%)	高浓度平均回收率% average recovery of high content （%）	相对标准偏差RSD%	替代物平均回收率%	低浓度平均回收率% average recovery of low content （%）	相对标准偏差RSD%	高浓度平均回收率% average recovery of high content （%）	相对标准偏差RSD （%）	平均加标回收率 average recovery of actual sample (%)		相对标准偏差 RSD (%)
Cholesterol	0.01	64.12	179.3	6.27	111.19	1.14	82.9	58.78	5.05	94.60	3.56		89.65	4.53
Campesterol	ND*		158.9	5.48	106.69	1.44		64.93	2.46	98.43	4.48		93.26	5.16
Stigmasterol	0.02		143.4	6.27	99.65	1.25		74.94	6.26	97.40	4.17		90.32	5.36
β-Phytosterol	0.05		232.3	7.48	104.26	1.09		75.31	4.23	99.74	4.28		91.63	6.23

 

2.4 实际样品的测定

本文分析了北京市同一季节2个不同城区和2个不同郊区的细颗粒物PM_2.5样品（每个样品连续采集24h）和同一餐馆的就餐时间段和非就餐时间段的细颗粒物样品（每个样品采集2.2h），将此6个实际样品按照上述前处理方法进行处理，经硅烷化后用气相色谱-质谱分析，得到每个样品中Sterols质量浓度如表3所示，实际样品得到的质谱图见图3。由表3可以看出胆固醇在四个不同区域中的质量浓度相差不大，说明胆固醇具有稳定的排放来源，不受地域的影响。餐饮源样品中四种Sterols化合物的质量浓度均远远高于其他区域样品，而非就餐时间的Sterols浓度也低于就餐时间段很多，说明烹饪过程中能排放出大量的甾醇类化合物，而不仅限于胆固醇。β-谷甾醇的浓度高于其他四种化合物的浓度，但是每个地区的浓度却不相同，说明不同区域的生物质分布状况不同。

表3 实际样品的测定结果

Tab.5 The detection results of Sterols in actual samples

化合物 compound	样品编号sample number/浓度Concentration(ng/m3)
	1#	2#	3#	4#	餐饮源1#	餐饮源2#
Cholesterol	0.48	0.51	0.53	0.46	29.25	9.44
Campesterol	ND	ND	0.31	0.52	57.75	13.48
Stigmasterol	ND	0.46	0.52	0.96	66.01	17.98
β-Phytosterol	1.03	1.06	7.02	3.54	166.65	42.58

图3实际样品的质谱图（序号参照表1）

Fig.3 Mass chromatograms of actual sample(serial number refer to table 1)

3结论

（1）采用超声提取-衍生化预处理的方法提取颗粒物样品中甾醇类有机示踪化合物，分别对萃取溶剂、衍生反应条件和前处理方式做了比较，确定以超声提取的方式，用二氯甲烷作为萃取溶剂，衍生反应条件定为100.0μL衍生试剂，在50℃的温度下反应20min。

（2）GC-MS分析技术检测甾醇类化合物得到各化合物工作曲线的线性良好，相关系数均在0.99以上，最低检出限在0.17-0.35ng/m³之间。

（3）对实际样品的分析中发现，胆固醇在不同的区域中有稳定的排放源。在餐饮源样品中发现甾醇类化合物的浓度均高于其他区域样品；β-谷甾醇的浓度高于其他四种化合物的浓度，但是每个地区的浓度却不相同，说明每个区域的生物质分布状况不同。也说明本方法适合颗粒物样品的测定，值得推广到其他类型的颗粒物样品中。

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