喹诺酮类药物诺氟沙星和四氰基乙烯荧光特性的研究

【核心介绍】采用荧光光谱研究了电子受体四氰基乙烯（TCNE）与电子给体诺氟沙星（NOFX）之间的荷移效应。实验结果表明，TCNE与NOFX的荷移反应需在丙酮-甲醇介质中进行并形成稳定的络合物，荷移反应络合物可使诺氟沙星产生显著的荧光增敏效应。据此提出了基于荷移效应简便可靠地测定诺氟沙星的荧光光谱的新方法，该方法用于诺氟沙星胶囊含量的测定，回收率为98.4%~ 100.9%，相对标准偏差（RSD）为2.5%。 　

喹诺酮类药物诺氟沙星和四氰基乙烯荧光特性的研究

吕玉光^1*, 宋笛¹, 石春卉², 高蕻冰¹, 杜梦圆¹, 杜浩然¹，葛争红³, 李莹¹, 李源作⁴

(¹佳木斯大学药学院，黑龙江，佳木斯，154007；²佳木斯大学 临床医学院，黑龙江 佳木斯, 154002；³北京联合大学生物化学工程学院，北京100029；⁴东北林业大学，理学院，哈尔滨150040）

摘要 采用荧光光谱研究了电子受体四氰基乙烯（TCNE）与电子给体诺氟沙星（NOFX）之间的荷移效应。实验结果表明，TCNE与NOFX的荷移反应需在丙酮-甲醇介质中进行并形成稳定的络合物，荷移反应络合物可使诺氟沙星产生显著的荧光增敏效应。据此提出了基于荷移效应简便可靠地测定诺氟沙星的荧光光谱的新方法，该方法用于诺氟沙星胶囊含量的测定，回收率为98.4%~ 100.9%，相对标准偏差（RSD）为2.5%。

关键词 荷移反应；荧光分析法；诺氟沙星；四氰基乙烯

中图分类号 R917

Research on Fluorescence Characteristics of Norfloxacin Quinolones and Four Ethylene

Lv Yuguang¹, Song Di¹, Shi Chunhui², Gao Hongbing¹, Du Mengyuan¹, Du Haoran¹, Ge Zhenghong ³, Li Ying¹,Li Yuanzuo⁴

(¹ College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007;² Clinical medical school, Jiamusi University，Jiamusi, Heilongjiang 154002;³ College of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100029;⁴ College of Science Northeast ForestryUniversity Harbin 150040）

Abstract The charge transfer effect between norfloxacin (NOFX) as the donor and tetracyanoethylene (TCNE) as the acceptor was studied by fluorimetry. The result showed that the norfloxacin and tetracyanoethylene need to form stable mixture of acetone and methanol, the complex can emit strong fluorescence. based on this method, a simple and reliable fluorescence spectroscopy method for determination of norfloxacin was developed. The method fits for the determination of norfloxacin capsule. Recovery of norfloxacin is 98.4%~100.9%, RSD is 2.5%.

Key words Charge transfer effect; Fluorimetry; Norfloxacin; Tetracyanoethylene

喹诺酮类是主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱（某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用）^[1]。诺氟沙星(Norfloxacin，NOFX)，别名力醇罗、氟哌酸、淋克星，为第三代喹诺酮类抗菌药，会阻碍消化道内致病细菌的DNA旋转酶（DNA Gyrase）的作用^[2-3]，阻碍细菌DNA复制，具有广谱抗菌作用，在临床上应用非常广泛^[4]。荷移反应^[5]是基于电子给体和电子受体之间的电荷转移形成荷移复合物的一类反应。将其应用于药物分析而形成的荷移荧光光谱法以其简单、快速、准确而展示出良好的应用前景^[6-7]。本文中NOFX分子中含有哌嗪基，有孤对电子可以供给电子受体。因此，我们选取TCNE为受体，研究NOFX和TCNE之间的荷移反应，这类荷移络合物具有特征的荧光光谱^[8-16]，测定方法简便易行。该法用于检测药物胶囊中诺氟沙星含量，结果灵敏度高、线性范围宽、回收率符合要求。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

970CRT荧光分光光度计（上海仪器分析制作总厂）；UV/Vis-265紫外-可见光分光光度计；诺氟沙星标准溶液：准确称取10 mg的诺氟沙星标准品（中国药品生物制品检定所，批号：00120000，纯度≥99.0 %），加少量甲醇溶解，配置成100 mg/L的标准溶液，使用时逐级稀释至所需浓度；四氰基乙烯标准液：准确称取64 mg四氰基乙烯标准品，加少量丙酮溶解，配置成5×10^-3 mol/L的标准溶液；其他化学试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

在10 mL具塞比色管中用移液管准确吸取适量诺氟沙星甲醇溶液，准确加入2.5 mL四氰基乙烯丙酮溶液，用甲醇定容至刻度，充分摇匀，封塞后在30 ℃水浴中保温30 min，冷却至室温，激发波长为331 nm，在437 nm处测定荷移反应产物的荧光强度，并做空白试验。

2 结果与讨论

2.1诺氟沙星荷移反应前后的荧光激发和发射光谱和紫外光谱

图1 NOFX-TCNE (3,3’)、NOFX (2,2’)、TCNE (1,1’)的激发和发射光谱

按实验方法配制试液，分别对所得荷移反应产物和诺氟沙星和空白试剂进行荧光激发和发射扫描。结果见图1。由图1可知，诺氟沙星自身可以发射荧光。与四氰基乙烯发生荷移反应后，虽然荧光激发和发射峰的位置没有明显变化，但荧光强度却显著增强，这表明诺氟沙星与四氰基乙烯荷移络合物的生成。

2.2四氰基乙烯用量的影响

分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、2.0 mL的四氰基乙烯加入到含有4 mL诺氟沙星的比色管中，用甲醇定容至刻度线，充分摇匀，在30 ℃水浴中恒温30 min，冷却至室温，测定其荧光强度，结果如图2所示。实验结果表明：当四氰基乙烯的用量在0.4 mL时荧光增强最大。浓度过低和浓度过高会导致荧光强度下降。

图2 四氰基乙烯的用量对荧光强度的影响 图3 诺氟沙星的用量对荧光强度的影响

2.3 诺氟沙星用量的影响

分别取1、2、3、4、5、6、7、8 mL的诺氟沙星溶液到含有0.4 mL四氰基乙烯的比色管中，用甲醇定容至刻度线，充分摇匀，30 ℃水浴中恒温30 min，冷却至室温，测定荧光强度，结果如图3所示。实验结果表明：当诺氟沙星的用量在5 mL时荧光增强最大。

2.4反应温度的影响

图4 反应温度对荧光强度的影响 图5 反应时间对荧光强度的影响

按实验方法，在固定其他实验条件不变的情况下，分别测定在20℃～60℃的水浴中诺氟沙星与四氰基乙烯电荷转移反应的荧光强度。结果如图4所示，数据表明从20 ℃起，随温度逐渐的升高荧光强度逐渐增强。当30 ℃以后荧光强度几乎不受温度的影响，所以30 ℃为本实验最佳反应温度。

2.5反应时间的影响

在所确定的温度条件下，分别选择反应时间为10 min～50 min的不同时间段进行荧光光谱观察，结果如图5所示，30 min时为诺氟沙星与四氰基乙烯发生电荷转移反应最佳反应时间。实验还发现荷移反应产物室温放置30 min荧光值无明显变化，说明所得络合物稳定性较好。

2.6 反应机理初探

四氰基乙烯是一个很强的平面型 π 电子受体，而诺氟沙星分子中的哌嗪基上的氮原子有一对孤对电子，可作为电子供体，与四氰基乙烯形成1:1的n-π 型荷移络合物，其形成过程可表示如图6。

图6 诺氟沙星与四氰基乙烯形成荷移络合物反应机理

2.7 标准曲线的绘制

在实验所确定的条件下，通过荧光强度与浓度之间的关系来绘制NOFX与TCNE形成的荷移络合物的标准曲线，标准曲线的相关系数列于表1。

表1 标准曲线

线性方程	Y=-63.676x+457.54
相关系数	-63.676
R²	0.8674

3 样品分析

将10粒NOFX胶囊研碎，准确称取其中的10%，用甲醇溶解，定容至100 mL容量瓶中，取10 mL用甲醇定容至100 mL，按上述方法检测，平行测定5次，并与药典法进行比较，结果如表2所示。

表2 诺氟沙星胶囊分析结果及回收实验 (n=5)

TCNE法			药典法
测得值(mg/粒)	相当于标示量(%)±SD	回收率	测得值	相当于标示量
96.3	96.31±0.92	99.6±1.2	96.1	96.1±1.0
	F=3.12(6.39)
	T=1.23(2.78)

4 结语

在一定条件下，诺氟沙星能与四氰基乙烯能够形成稳定的n-π 络合物，与诺氟沙星相比，所得络合物的荧光强度较大幅度的增强,有效地测定了药物制剂中诺氟沙星的含量。随着对配合机理的深入探讨，在将来的研究中如能拓宽电子接受体系的选择范围，或采用传统的荷移荧光光谱分析与多种监测仪器联用的动力学方法，都将促进荷移荧光光谱分析法的推广与应用。

5致谢

感谢国家自然科学基金项目(21346006), 黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201510222035), 黑龙江省科技厅科研项目(B201506), 佳木斯大学交叉学科类科学研究项目(JC2014-005), 佳木斯大学校长创新创业基金(xzyf2014-18), 佳木斯大学研究生科技创新重点项目(LZR2015_021) 和佳木斯大学教育科研项目(JKA2014-042)大力支持。

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