用于环境监测的生物检测技术进展

【核心介绍】随着环境保护得到普遍关注，环境监测仪器和监测技术的应用也迎来新机遇。传统化学监测技术广泛应用于环境监测，目前已经可以对痕量、超痕量化学物质进行监测，但仍无法通过传统监测技术对环境准确评价，因此新兴的生物检测技术开始应用于环境监测。文章列举了国内外的应用实例，以期能够进一步促进基于生物检测技术的监测仪器的发展。 　

用于环境监测的生物检测技术进展

张 鹏¹，齐文启¹

（1.中国环境监测总站，北京  100012）

摘  要 随着环境保护得到普遍关注，环境监测仪器和监测技术的应用也迎来新机遇。传统化学监测技术广泛应用于环境监测，目前已经可以对痕量、超痕量化学物质进行监测，但仍无法通过传统监测技术对环境准确评价，因此新兴的生物检测技术开始应用于环境监测。文章列举了国内外的应用实例，以期能够进一步促进基于生物检测技术的监测仪器的发展。

关键词 环境监测；超痕量监测；生物传感器

中图分类号 X830.2

Development of Biological Detection Technology for Environmental Monitoring

Zhang Peng¹, Qi Wenqi¹

（¹China National Environmental Monitoring Centre， Beijing 100012，China）

Abstract With the environmental protection has been widespread concerned, it is an opportunity for more technology and instruments to apply for environmental monitoring. Although the traditional technology is used to monitor the trace and ultra trace chemical substances, it can not evaluate living environment. That is the reason for the biological detection technology is widely used in environmental monitoring. The article lists application examples of the domestic and foreign, it is hoped to promote the development of monitoring instruments ,

Key words Environment monitoring；Ultra trace monitoring；Biosensor

环境监测是管控污染源排放，监控生态环境变化的重要手段。通过松花江水污染事件、天津8.12爆炸事故我们可以深切地感受到公众对于环境监测数据的迫切需求，环境监测仪器与技术发展方向就是要公正客观的评价环境。

1. 环境监测面临的问题

随着化工技术的不断发展，使环境污染物的成份日益复杂。除了常生产及使用的2万多种有毒有害的化学物质外，值得特别关注的还有用于人类疾病治疗和养殖业正常或非法使用的抗生素类药品（至少也有2800余种），此外，香精、色素、保鲜剂、防腐剂等食品添加剂也大量使用，如果管理不当，它们都可能会对环境造成危害。人、畜、禽、鱼类使用的抗生素等化学药品只有少量能被吸收，在6~20h之内会有15%~80%排入社会环境，给环境造成危害的同时也给水的自净能力造成极严重的影响^[1]。国际化学物质管理战略（SAICM）要求严格限制这类化学物质生产量和使用量，并且在2020年其对生态环境和人体健康的影响要明显减少^[2]。欧共体和美国也积极响应，对2014年2月登录的9000多万种化学物质中的3000余种监测进行切实的危害的评价^[3]。有效的对这些高风险的化学物质进行管控是国内外通用的应对之策，而监测是管控的重要手段之一。面对经济高速发展引起的日益复杂的环境问题，监测技术进步以及监测仪器的研发变得尤为重要。

2. 化学监测技术的发展

污染物定性定量的监测技术由ppm级向ppb级，甚至是ppt、ppq级的转变是监测的重要发展趋势之一。ppm浓度级的仪器设备和技术，以急性毒性和环境标准规定的环境污染物为监测对象。ppb级甚至ppt级浓度的监测仪器和技术，以慢性毒性物质，POPs类，对生态破坏的人、畜用医药类及“三致物质”为对象。ppb级甚至ppt级浓度的监测则是对环境监测的更高要求，对生态环境及人类健康的影响也十分重要。目前关注度比较高污染物如内分泌干扰物类，二噁英类，抗生素类医药品等的监测就必须采用ppt级甚至ppq级的监测仪器和技术。

二噁英类物质由于对人体健康的高危害而受到广泛关注，其毒性是氰化物的130倍，砒霜（As₂O₃）的900倍左右。垃圾、危废焚烧项目的验收，就要开展二噁英类的有组织及无组织排放的监测，甚至是要对周边的土壤和环境空气进行监测，无组织排放及环境空气当中的二噁英类的浓度通常小于0.02pgTEQ/m³。日本环境质量现状调查结果表明二噁英在空气中的含量（样本数676）是0.0047~0.58pg TEQ/m³, 在地表水（样本数1571）中0.0084~2.6pg TEQ/L，河湖底质（样本数1296）中0.042~700 pg TEQ/g，地下水（样本数546）中0.084~1.6pg TEQ/L，土壤（样本数917）中0~150pg TEQ/g^[4]。在如此低的浓度下，通常需要选取HRGC/HRMS法进行测定。

家禽、畜牧业违规使用内分泌干扰物、蔬果使用的生长激素等对生态环境及人体健康危害也受到广泛的社会关注。这类化学物质只有采用LC-MS-MS方法才能进行有效监测。海河水利委员会在中-法合作项目中正在开展海河流域的内分泌干扰物的调查。

养殖业违法使用抗生素给人体健康和生态环境造成极其严重的危害。据统计我国是最大的抗生素生产和使用国，平均每人每年使用134g抗生素，如此大的量应当引起关注^[5]。2015年5~6月，我国食品药品监督管理总局从11批次猪肉，鸡肉中检测出氯霉素，硝基呋喃类，磺胺类和喹诺酮类药物。人体长期摄入硝基呋喃类药物可能引起溶血性贫血、多发性神经炎，眼部损伤和急性肝坏死，并有一定致癌性。长期摄入磺胺类药物可能会导致泌尿系统和肝脏损伤，还会发生过敏反应等。喹诺酮类药物若在人体内残留积蓄，可能引起人体的耐药性。抗生素不仅中国养殖业使用，日本也极为严重，跟据野见山桂等人的研究，在日本每只鸡抗生素的投喂量是94mg/kg，猪是20 mg/kg，畜产业85%的废弃物和污水处理产生的污泥35%施肥于绿地，其中包含的抗生素类物质受雨水淋溶进入河流和地下水。他们调查的4类抗生素和5种抗菌剂普遍存在于地表水和底泥中^[6]。

抗生素类的药品可以采用LC-MS-MS方法进行测定。内藤宏孝发表了LC-MS-MS测定水中抗生素及其代谢产物的论文^[7]。他采用LC-MS-MS方法成功测定了地表水中的四环素类抗生素，其中有金霉素、土霉素、强力霉素、四环素及金霉素降解产物。其监测方法是在水样中加入EDTA-二钠，然后采用固相萃取，并以甲醇－0.1%甲酸（1+1）水溶液洗脱，最终采用LC-MS-MS测定。上述5种抗生素类的检出限分别是6.2ng/L，2.9ng/L，4.2ng/L，3.0ng/L和2.8ng/L。对地表水水样的检测结果表明最大浓度分别为59ng/L，610ng/L，280ng/L，27ng/L和52 ng/L。方法的加标回收分别为89~99%，96~106%，80~87%，99~100%和94~105%。

GC-MS(HRGC/HRMS)、HPLC-MS、ICP-MS. GC-MS-MS LC-MS-MS被称为质谱三兄弟，在实验室内使用这些仪器可以有效的对痕量、超痕量化学物质进行监测，但是这些方法所用的设备体积大、实验环境适应条件苛刻，实验操作过程复杂，通常需要前处理，在现场进行快速的分析比较困难。

3. 生物检测技术的应用

美国化学会（ACS报告）至2014年9月登录的化学物质有9000万种，并且在逐年增加。目前生产，使用排放废弃的化学物质至少在2万种以上。从环保角度看，发达国家严格管控的化学品在462种以上^[8]。如此多的化学物质都会对环境产生一定的污染，如果逐一检测所需的人力、财力和技术往往相对困难。众所周知，长期使用农药杀虫效果就会大大降低，因此农药更新很快，但是目前我国仅能检测20余种农药类，而日本检测管控579多种，美国360多种，德国325种，加拿大251种，荷兰也管控210种以上，可见在农副产品，果蔬等食品类进口和国际贸易方面，我们的检测及管控大大落后。生产这些农药类药品的过程中对生态环境的影响更是难以管控。同样的，人长期使用同种抗生素也会失去作用，所以医药公司也在不断研发新的医药品，抗生素的种类也在逐年增加。

目前，我国的监控主要集中在一些常规的化学监测指标，虽然监测指标的数量在逐步增加，以饮用水为例，监测的指标由原来的40余项增加到109项。但是相对于存在的化学物品来说还是太少了。从环保角度来看，凡是存在的化学品都有可能对环境造成污染，比如香精、色素等食品添加剂本身并不是污染物质，但是他们会对水的自净能力产生影响，间接导致水质的恶化。由于在环境载体中化学物质会发生相应的化学反应，理论上说应该对所有化学品及其衍生物逐一进行监测，从而确定水体的安全，但这几乎是不可能完成的。即便是完成了，单纯的化学监测手段只能是定性、定量分析，无法判断污染物质的生物利用率、基因毒性等因素，不能说清这些污染物质对环境的影响，比如马拉硫磷与苯硫磷的协同作用就无法用化学监测手段进行监控。因此，生物毒性的检测技术得到了突飞猛进的发展，成为了新兴的管控手段。用生物传感器或生物毒性来监测排放的化学物质对环境的影响，在欧美起步较早，其中ISO标准体系中的TC147水质标准中已经分别对微生物学方法和生物学方法制定了相关标准。微生物学方法标准由德国制定，其中包含了大肠杆菌、亚硫酸盐还原菌等可培养菌的纯培养技术体系，PCR方法体系等技术方法。生物学方法标准由英国制定，其中包括通过污水对藻类生长的抑制、对发光菌发光效应的抑制以及通过淡水鱼来鉴定毒性的方法。韩国和日本在2013年3月也已实施^[8]。生物传感器具有简单、快速、安全、无二次污染的优点。这类生物分析技术不仅可以测定环境样品中重金属类，DCPs（有机氯农药）、PCBs（多氯联苯），PAHs(多环芳烃)，二噁英类，抗生素类等污染物质，还可鉴定其生物毒性。目前生物传感器在环境监测应用比较广泛的有：

（1）微生物传感器

与组织传感器和细胞传感器一样是酶生物传感器的衍生，解决了酶分离及固定的难题，同时生物活体可以发挥各种酶及辅酶的协同作用。微生物传感器的最早应用是Microtox法，Microtox毒性测试技术的核心是一种从太平洋海洋生物中分离培养的发光细菌，这种细菌名为费希尔狐菌(Vibrio fischeri)，进行新陈代谢时会发光，当新陈代谢降低时，发出的光就会减弱。Microtox急性毒性测试技术就是利用这种发光细菌的特性，通过检测待测样品对其发光抑制作用的强弱来判定待测样品的总的毒物效应。该技术已经在很多国家被用来检测饮用供水系统，目前主要应用于美国各大城市，主要作用是监测因为事故或故意破坏造成的污染。急性毒性测试可以在15min内完成，操作过程技术要求低，因而，能保证在现场对水质变化进行快速反应。Microtox毒性测试系统可以快速展现饮用水中毒性的细微变化，是有效的供水卫生管控方法。在宿主细菌内植入基因片段从而得到改性菌种的研究不断深入，lacZ、luxAB、luxCDABE、绿色荧光蛋白（GFP）等基因片段的应用^[9]，使得微生物传感器得到了极大的进步。改性后的细菌传感器不但可以对砷、汞、镉、铅、铜、铬、锌、金等重金属及类金属元素进行监测^[10~12]，还可以对萘、苯系物、酚类等有机污染物进行监测^[13~15]，甚至是抗生素类^[16]。除了细菌之外，以蓝藻、绿藻、真菌、原生动物等构建的微生物传感器也都成功应用于检测^[17]。

（2）免疫传感器

免疫传感器主要是利用抗原和抗体结合成免疫复合物的特异性反应。主要有标记免疫法和非标记免疫法。

标记免疫法主要有用酶标记的酶联免疫法（ELISA）、用示踪剂标记的荧光免疫法（FIA）、用化学发光物质标记的化学发光免疫分析法（CLIA）。自德国2000年3月15日公布了DIN ISO15089水质监测标准以后，以ELISA法为代表的免疫学方法逐步得到国际认可，其中在EPA发表的生物监测手册中规定ELISA法是食源性病菌的认证监测方法，EPA颁布的4000系列方法规定ELISA、FIA、CLIA等免疫学方法为五氯酚、氯丹、DDT、多氯联苯等有害废物的认定监测方法。并且EPA还打算把ELISA法作为水中内分泌干扰物的认证监测方法。日本的JIS K0461标准方法也规定了用该方法测定水和土壤中农药及其降解产物，内分泌干扰物，雌性激素。 在我国也有关于免疫学方法应用于环境监测的报道，ELISA法成功用于监测二噁英，FIA法成功用于监测多环芳烃，CLIA法也成功用于监测呋喃唑酮、百菌清、恩诺沙星及有机磷农药等化学物质^[18~19]。同时，标记免疫技术也在不断发展，例如以ELISA为基础发展出的酶联免疫斑点检测（ELISPOT），以FIA为基础发展出的时间分辨荧光分析法（TRFIA）都得了应用。

非标记免疫传感器的热门应用目前有直接电化学免疫传感器，石英晶体微天平免疫传感器（QCM），表面等离子体共振传感器（SPR）等。其中直接电化学免疫传感器又分为电压型、电流型、阻抗型、电容型。Omowunmi Sadik^[20]等人利用直接电化学免疫传感器成功对PCBs进行了监测，其中多氯联苯1242、1248、1254和1016的检出限分别为3.3 ng/mL、1.56 ng/mL、 0.39 ng/mL和1.66 ng/mL 。该传感器对PCBs具有高选择性，能够不受氯代苯甲醚类、苯系物、酚类有机物的干扰。Anthony J. Killard^[21]等人将电流型电化学免疫传感器用于对环境中的阿特拉津进行实时监测，并且其检出限只有0.13μM (28 ppb)。此外，阻抗型等其他免疫传感器感还可用于卡那霉素、青霉素、PAHs的监测^[22~24]。石英晶体微天平免疫传感器是一种压电免疫传感器，通过测量石英晶体振荡频率的改变，从而监测抗原与抗体特异性结合后产生的微小质量变化。 Ya Yang等人用石英晶体微天平免疫传感器对氯胺酮进行了监测，其检出限为0.86 pg/mL，方法的加标回收为91.8%~100%^[25]。此外，该方法还可用于二噁英类物质的监测^[26]。表面等离子体共振传感器（SPR）是一种光学免疫传感器，可以用于监测禽蛋类的尼卡巴嗪残留^[27]、饮用水中的铜离子和镍离子，并且可达到ppt级水平^[28]，活体中的氨基苯并咪唑类兽药残留^[29]以及杀虫剂的残留^[30]。

4. 结论

随着经济的高速发展，我国面临的环境问题日益复杂。民众的环境意识不断增强，大家对“天蓝、地绿、水净”的环保诉求空前高涨。用于监控环境质量，污染源排放的监测仪器是满足群众环保知情权的有效工具，这些仪器应该具有分析快速，操作简便，特异性强，灵敏度高，便于携带等特点，无论是传统化学检测方法，还是新兴生物检测方法都在向这个目标发展。就目前来说，传统化学检测技术方法正广泛应用于环境检测，但是其发展空间远小于生物检测技术。随着纳米技术、计算机科学的不断发展，以生物传感器为代表的生物检测方法高速发展。相信未来规模大，集成化好、敏感度高、特异性强的生物检测方法将会更多的应用于环境监测。

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