刑侦新科技，毒枭已哭晕在厕所

【核心介绍】本文建立了尿液中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的定性定量分析方法。尿液调碱性（pH为9-10）后采用乙酸乙酯小体积提取，离心后上清液直接进行GC-MS分析，具有操作步骤简单、快速，且回收率高、提取物杂质少、灵敏度高等优点，能满足日常办案及临床检验的需要。 　

关于去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱及其代谢物的检验方法，国内外已有报道，多采用液相色谱及液相色谱质谱联用方法。国内文献尿液中的检验方法尚未见报道。本文研究人尿液中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的GC-MS检测方法，希望对刑事技术工作者及临床工作者有所借鉴。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-TQ8030三重四级杆气相色谱/质谱联用仪，日本岛津公司；2420低速离心机（日本KUBOTA公司）；BT125D型电子分析天平，（德国赛多利斯科学公司）；10-XC-88L医用低温箱，（合肥市齐美电器有限公司）。

去氢骆驼蓬碱对照品（纯度≥98%）、骆驼蓬碱对照品（纯度≥98%）及SKF₅₂₅(纯度≥99.8%)(均购于美国Sigma公司)。氯化钠、甲醇、乙酸乙酯为分析纯。

1.2 色谱质谱条件

色谱条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30.0m×0.32mm×0.25μm），柱温：初始温度150℃，保持1min，升温速率10℃/min，至280℃恒温6min；载气：He，流量1min/mL；分流进样，分流比10:1；进样体积1μL。质谱条件：EI电离源，电子束能量70eV，离子源温度250℃，接口温度270℃，溶剂延迟测定时间2min.质量范围：50-450aum，扫描方式全扫描SCAN。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取25.10mg的去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱标准物质，用甲醇定容至25mL，配成1.0mg/mL的标准对照品储备溶液，于-20℃下保存。准确称取10.00mg SKF₅₂₅，用甲醇定容至10mL,配成1.0mg/mL的标准内标储备溶液，-20℃保存。

分别准确吸取1mL的标准对照品储备液，用甲醇定容至10mL，配成100.0μg/mL的混合标准工作溶液，-20℃保存。准确吸取1mL的标准内标储备液，用甲醇定容至50mL，配成20.0μg/mL的标准内标工作溶液，-20℃保存

1.4 样品前处理

量取5mL的人尿液到15mL的离心管中，加入50μL内标溶液（20.0μg/mL）、1%的氢氧化钠调pH至9-10和1.60g氯化钠至饱和，振荡混匀，加入1mL乙酸乙酯，超声10min，4000r/min离心5min，转移上清液至进样瓶内供GC-MS分析。

2 结果与讨论

2.1 专属性

在选定的GC-MS条件下，空白尿样经前处理后在相同的色谱条件下无干扰，说明方法的专属性较好（见图1）。尿样中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱均具有良好的色谱峰，与杂质完全分离，基峰分别为212m/z和213m/z（见图2）。

图1空白尿液总离子流色谱图

图2 去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱和SKF₅₂₅的总离子流色谱图

去氢骆驼蓬碱 RT=9.331min，骆驼蓬碱RT =8.954min，SKF₅₂₅RT=10.036min

2.2 标准曲线

取适量标准溶液稀释成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、 20.0μg/mL的去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱系列混合标准对照品工作溶液,内标浓度为1μg/mL。各取lμL，在GC/MS条件下依次进样分析。以标准浓度为横坐标，标准物质色谱峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程分别为Y=0.6431X-0.0571，R²=0.9998、Y=0.4505X-0.1344，R²=0.9992；线性范围分别为0.01-20.0μg/mL、0.05-20.0μg/mL。

2.3 工作曲线

量取人空白尿液5 mL，分别添加50μL相应系列混合标准对照品溶液将其配制成浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/mL的加标尿液，50μL内标溶液（20.0μg/mL），每个浓度平行做6份，然后按1.4样品萃取方法进行提取，GC-MS测定。以内标法做线性回归。求得尿中去氢骆驼蓬碱的回归方程为Y=3.6018X-0.0618，R²=9994，线性范围0.005-2.0μg/mL，最低检出限为0.005μg/mL（S/N=15.6见图3）；骆驼蓬碱的回归方程为Y=1.5786X-0.0556，R²=0.9985，线性范围0.01-2.0μg/mL，最低检出限为0.01μg/mL（S/N=10.4见图4）。从图5也可以看出，去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱均呈良好的线性，且线性范围宽，检出限低。

图3去氢骆驼蓬碱浓度为0.005μg/mL的选择离子色谱图

图4骆驼蓬碱浓度为0.01μg/mL的选择离子色谱图

图5去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的工作曲线

2.4 准确度和精密度

量取人空白尿液5mL，分别添加系列混合标准对照溶液50μL，配制成高中低3种浓度(1.2、0.4、0.04μg/mL)的尿样，每个浓度平行做5份，一天内早中晚分别测3次，连续测5d。以工作曲线计算浓度，求得准确度和精密度(见表1)。由表中数据可以看出，准确度在96%-101%之间，日内和日间精密度(RSD)均在10%以下。

表1 准确度和精密度结果（n=5）

物质	添加量	准确度		精密度（RSD，%）
	（μg/mL）	测得值（μg/mL）	相对回收率（%）	日内	日间
去氢骆驼蓬碱	0.04	0.039±0.002	96.55±6.11	5.25	6.33
	0.40	0.393±0.039	98.23±9.73	6.56	9.91
	1.20	1.158±0.115	96.50±9.60	5.02	9.94
骆驼蓬碱	0.04	0.041±0.003	101.53±6.88	5.08	6.77
	0.40	0.392±0.035	97.92±8.74	7.50	8.92
	1.20	1.172±0.082	97.65±6.86	4.54	7.03

2.5 萃取回收率

取空白人尿液5mL，分别添加系列标准液50μL，配制成高中低3种浓度(1.0、0.5、0.05μg/mL)的尿样，每个浓度平行做5份。经液液萃取后供GC-MS分析，所得峰面积与相应标准的峰面积进行比较，评价方法的萃取回收率。去氢骆驼蓬碱3种浓度的回收率分别为（85.73±3.23）%、（89.03±0.70）%、（92.46±2.75）%，

平均回收率为89.08%；骆驼蓬碱的3种浓度的回收率分别为（68.57±3.36）%、（69.54±3.39）%、（68.51±1.37）%，平均回收率为68.87%。两种化合物的回收率均在68%以上，满足日常办案的要求。

2.6 稳定性试验：

取已制备好的标准混合溶液（- 20℃保存），分别在0、1、2、5、10、15d进样，测定峰面积与内标峰面积所得的去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的RSD分别为1. 03% 和4.01%。表明标准对照品在15d内稳定。Björnstad等人研究表明去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的标准对照品在- 20℃情况下至少可以保存9个月。

2.7 萃取条件的选择

萃取溶剂和pH的选择：采用正交法用不同溶剂（乙酸乙酯、环己烷、乙醚、二氯甲烷）及不同pH（7、8、9、10、11、12）进行萃取，观察尿中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的回收率。使用乙酸乙酯做萃取溶液时发现，在pH=9-10时，去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的回收率最高，分别为86.74%和60.73%。在使用正己烷时，骆驼蓬碱在不同pH下均不出峰。使用乙醚时，pH=7、8、9时回收率较高在60%以上，但是由于其易挥发，离心出的液体较少，不利于实际操作。二氯甲烷做萃取溶剂时，pH ＞7的时候回收率均较高，尿中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的回收率最高分别为81.44%和59.39%，但是因其在下层，实际操作较困难。综合考虑回收率及实际操作，因此本实验选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

氯化钠加入量的选择：尿液中加入氯化钠可以增加液液萃取的回收率，本实验添加了三种不同量的氯化钠（1.00g、1.60g、2.00g），其中添加1.60g是其在5mL的尿液中刚好饱和的添加量。实验发现添加1.60g氯化钠的回收率确实较添加1.00g氯化钠的回收率高，分别为89.63%和68.49%。就回收率而言，添加2.00g氯化钠使其呈现过饱和状态，没有发现其显著提高。因此本实验选择添加1.60g氯化钠。

本文建立了尿液中去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱的定性定量分析方法。尿液调碱性（pH为9-10）后采用乙酸乙酯小体积提取，离心后上清液直接进行GC-MS分析，具有操作步骤简单、快速，且回收率高、提取物杂质少、灵敏度高等优点，能满足日常办案及临床检验的需要。

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