衍生化-UPLC-MS/MS法测定面粉中的偶氮甲酰胺

【核心介绍】本文建立了面粉中偶氮甲酰胺（ADA）的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。面粉经湿热处理，ADA转化为氨基脲（SEM），加入内标溶液和2-硝基苯甲醛后衍生化，经HLB固相萃取柱净化后，乙酸乙酯洗脱，采用电喷雾正离子模式(ESI+)检测，内标法定量，通过测定SEM衍生物的量间接计算面粉中ADA的含量。该方法的定量限为0.4 mg/kg；在0.2~5 mg/kg浓度范围内，R2大于0.99；添加浓度为0.4 mg/kg、0.8 mg/kg、4.0 mg/kg时，回收率为89.2% ~ 1 　

衍生化-UPLC-MS/MS法测定面粉中的偶氮甲酰胺

马立利^*，曹沅¹, 胡艳霞²,曹英华¹, 贾丽¹, 范筱京¹

（1.北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089;

2. 华北制药集团爱诺有限公司，石家庄052165）

摘 要：本文建立了面粉中偶氮甲酰胺（ADA）的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。面粉经湿热处理，ADA转化为氨基脲（SEM），加入内标溶液和2-硝基苯甲醛后衍生化，经HLB固相萃取柱净化后，乙酸乙酯洗脱，采用电喷雾正离子模式(ESI+)检测，内标法定量，通过测定SEM衍生物的量间接计算面粉中ADA的含量。该方法的定量限为0.4 mg/kg；在0.2~5 mg/kg浓度范围内，R²大于0.99；添加浓度为0.4 mg/kg、0.8 mg/kg、4.0 mg/kg时，回收率为89.2% ~ 116.7%，RSD为7.8% ~ 13.2%。该方法灵敏度高，定性定量准确，适宜于面粉中偶氮甲酰胺的分析检测。

关键词：面粉；偶氮甲酰胺（ADA）；氨基脲（SEM）；超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）

中图分类号：TS211.4

Determination of Azodicarbonamide in Flour by

UPLC-MS/MS Afterderivatization

Ma Lili¹, Cao Yuan¹, Hu Yanxia²,Cao Yinghua¹, Jia Li ¹, Fan Xiaojing¹

（1.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing 100089, China; 2.North China Pharmaceutical Group Aino Co., LTD., Shijiazhuang 052165, China)

Abstract: An ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of azodicarbonamide (ADA) in flour after wet heat processing and derivatization with 2-nitrobenzaldenhyde. The derivatized samples were purified by Oasis HLB solid phase extraction cartridges, then was analyzed by UPLC-MS/MS with electrospray ionization, operated under positive ion mode. ADA in flour was quantified according to the amount of SEM by internal standard method. The limit of quantification was 0.4 mg/kg, and a good linearity of calibration curve was obtained in the range of 0.2~5 mg/kg with the linear regression coefficients (R²) higher than 0.99. Average recoveries for spiked samples at 0.4 mg/kg, 0.8mg/kg, and 4.0mg/kg were in the range from 89.2% to 116.7% with RSDs from 7.8% to 13.2%. The method is reliable, high sensitive, and accurate to be used for determining ADA in flour.

Keyword: flour; azodicarbonamide (ADA); Semicarbazide (SEM); ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

2014年2月，美国快餐巨头赛百味承认其在北美出售的食物中含有偶氮甲酰胺，并宣布停用此成分。之后麦当劳、星巴克都被爆出使用了这种添加剂。由于偶氮甲酰胺还常被用作塑料橡胶鞋底的发泡剂，这一消息引发了消费者的担忧。

偶氮甲酰胺（Azodicarbonamide，ADA）又名偶氮二甲酰胺，分子式为C₂H₄N₄O₂。商品名为发泡剂AC或发泡剂ADC，是一种白色或淡黄色粉末，无毒，无嗅，不易燃烧。其在低剂量时可对小麦粉进行安全快速的氧化，以改善面团的物理性能和高筋面团所需的组织结构。我国GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定小麦粉中的ADA最大使用量为0.045 g/kg。但是基于安全考虑，欧盟、澳大利亚、新西兰、南非、日本和新加坡等国家和地区禁止在面粉中添加ADA^[1]。

常温下，ADA在干面粉中比较稳定，但在特定条件下（湿润、酸性和高温）可发生降解^[2,3]，转化为联二脲（Biurea），最后转变成致癌物——氨基脲（Semicarbazide，SEM），其降解机理如图1所示。而SEM具有潜在的弱毒性和致癌性^[4]，会对人体产生危害。因此，面粉中偶氮甲酰胺的分析方法的开发尤为重要。而当前其检测方法主要为高效液相色谱法^[5-1010]，但由于ADA极性强，其在反相色谱柱上的保留较弱，从而往往出现目标峰与溶剂峰等杂峰分离度较小、样品回收率低、检出限高等问题^[9]。

目前，有关食品中SEM的分析方法的报道较多。Tian等^[11]较全面地介绍了SEM的分析方法，包括前处理和检测方法，指出常用的前处理方法包括液液萃取和固相萃取，不同种类的样品所用提取溶剂和净化方式有差异。常用检测方法有免疫吸附法（酶联免疫法、荧光免疫分析法、胶体金免疫层析法）、高效液相色谱法、液质联用法等，并分析了各种方法的适用范围和优缺点。另外，该文详细阐述了不同食品中SEM的分布情况，以及其蓄积毒性、对染色体造成畸变、引起基因变异、干扰内分泌等毒害作用。

Li等^[12]采用2-（11H-苯[a]咔唑）乙基氯甲酸酯（BCEC-Cl）为荧光标记试剂，与SEM反应后利用荧光检测器分析面包、方便面、猪肉等食品中的SEM含量，该方法相对简单、快速，检出限为0.4 μg/kg；Wang等^[13]同样采用荧光检测器分析鱼和面包中的SEM，选用芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）为荧光标记试剂，鱼中目标物的定量限可达0.5 μg/kg。该类方法相对高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）的前处理步骤简单，回收率较高，且不需要昂贵的仪器；但是所用酰氯类试剂易水解，稳定性差，其合成和保存有一定的难度^[14]，且该方法缺少净化步骤，容易对仪器造成污染。

Becalski等^[15]利用¹³C¹⁵N₂-SEM为内标，酸性水解后衍生化，之后采用乙酸乙酯液液分配净化，LC-MS/MS法定量分析11种面包各3个批次中SEM的含量。结果表明，在加拿大的面包产业中，ADC是普遍添加的，但均小于45mg/kg的限量值。该方法中SEM的检出限为1ng/g。

而Mulder等^[16]证明食品中SEM有两种不同的来源——呋喃西林代谢或ADA降解，所以单纯测定SEM无法准确获得样品中ADA的含量。

Chen等^[17]首次同时测定面粉中的ADA和SEM，以芴甲氧羰基氯（FMOC）为衍生剂，乙酸乙酯液液萃取净化后采用毛细管电泳法检测，ADA和SEM的定量限分别为0.5 mg/kg、0.15 mg/kg。但是毛细管电泳法测定时重现性较差，且ADA在前处理过程中会有部分转化成SEM，导致定量结果不准确。

本文将面粉进行湿热处理，偶氮甲酰胺转变成氨基脲，然后对其进行衍生化，采用超高效液相色谱-质谱联用仪测定。

图1 偶氮甲酰胺的降解机理

Fig. 1 Degradation mechanism of ADA

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

UPLC-ESI-MS/MS，配备有ACQUITY超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S串联四级杆质谱仪（美国Waters公司）；涡旋仪（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；Elix 10 Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；高速冷冻离心机（日本Hitachi，CR22GⅢ）； ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1×50 mm，1.7 μm，Waters公司）；气浴恒温振荡器（金坛市江南仪器厂，SHZ-82A）；0.22 μm微孔滤膜（天津津腾科技有限公司）；HLB固相萃取柱（Waters Oasis，60mg/3mL）。

偶氮甲酰胺标准品购于Toronto Research Chemicals公司，先用二甲基亚砜溶解，再用甲醇稀释到所需浓度；SEM、¹³C¹⁵N-SEM标准品购于Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸均为色谱纯，购自Fisher公司；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、氢氧化钠、盐酸、2-硝基苯甲醛、二甲基亚砜均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 样品处理

（1）样品提取

称取1g（精确至0.01 g）面粉于50 mL试管中，加入8 mL 0.2 mol/L盐酸，涡旋1 min。放于烘箱中反应1 h，取出冷却至室温。转移至50 mL塑料离心管中，加2 mL上述盐酸溶液洗涤试管后合并至离心管中。加入0.3 mL 0.05 mol/L的2-硝基苯甲醛及0.1 mL 100 ng/mL ¹³C¹⁵N-SEM溶液，涡旋混匀，置于37 ℃恒温振荡器上振荡16 h。取出离心管放置至室温，加入5 mL K₂HPO₄溶液、10mol/L NaOH溶液调节pH=7.4(±0.2)，10000 r/min离心10 min。

（2）样品净化

将HLB净化柱放入固相萃取装置的指定位置，依次用 3 mL甲醇、6 mL水活化。取提取液全部过柱，用5 mL 水淋洗，6 mL乙酸乙酯洗脱至10mL离心管中。在氮吹浓缩装置上于50 ℃吹干，用甲醇-0.1%甲酸溶液（体积比为1:9）定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜后待测。

1.3基质标准溶液的配制

称取1 g阴性面粉样品，添加不同质量浓度的偶氮甲酰胺标准溶液——0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照1.2对样品进行处理后供仪器测试。

1.4 仪器条件

（1）色谱条件

柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5.0 μL；流动相 A为甲醇，流动相 B为二次水；二元梯度分离，梯度顺序：0~2.5 min，90%~10% B；2.5~3.0 min，10% B；3.0~5.0 min，90% B。

（2）质谱条件

电喷雾电离（ESI+）离子源；离子源温度为150 ℃；毛细管电压3.0 kV；脱溶剂温度 450 ℃；脱溶剂气（氮气）流量为800 L/Hr。两种目标物的采集参数列于表1。

表1 SEM及¹³C¹⁵N-SEM衍生物的质谱采集条件

Table 1 Optimization conditions of SEM and ¹³C¹⁵N-SEM derivatives in

mass spectrometric analysis

目标物	tR/min	母离子 （m/z）	子离子 （m/z）	驻留时间 /s	裂解电压 /V	碰撞能量 /eV
SEM的衍生物	2.25	209.0	165.8* 191.9	0.025 0.025	28 28	10 12
13C15N-SEM的衍生物	2.25	212.0	167.8*	0.025	28	10

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本文比较了不同的流动相和定容溶剂对目标物的峰形和响应值的影响。其中流动相选择（1）甲醇-0.2%甲酸+10 mM乙酸铵、（2）乙腈-0.2%甲酸+10 mM乙酸铵、（3）甲醇-0.1%甲酸、（4）乙腈-0.1%甲酸、（5）甲醇-5 mM乙酸铵、（6）乙腈-5 mM乙酸铵、（7）甲醇-水、（8）乙腈-水共8种；定容溶剂为①甲醇、②乙腈、③甲醇-水（1:9）、④乙腈-水（1:9）、⑤甲醇-0.1%甲酸（1:9）、⑥乙腈-0.1%甲酸（1:9）、⑦甲醇-5 mM乙酸铵（1:9）、⑧乙腈-5 mM乙酸铵（1:9）。结果表明：以甲醇或乙腈为定容溶剂时，8种流动相都不能得到较好的峰形；乙腈为流动相或定容溶剂普遍比甲醇响应低；甲醇-0.1%甲酸（1:9）为定容溶剂相比其他7种方案在任何流动相情况下响应都是最高的，以其为溶剂，甲醇和水为流动相时峰形较好，并且响应值也最高，所以本文选择（7）⑤，即以甲醇和水为流动相，甲醇-0.1%甲酸（1:9）为定容溶剂。

2.2 质谱条件的确定

SEM的分子量仅为75 g/mol，且有较严重的基质效应，利用ESI+检测时灵敏度较低，引入2-硝基苯甲醛衍生化后离子化效率提高^[1]，其衍生化反应原理如图2所示。

取0.1 mL 1 mg/L SEM和¹³C¹⁵N-SEM标准溶液于两个50 mL离心管中，均加入10 mL 0.2 mol/L盐酸和0.3 mL 0.05 mol/L的2-硝基苯甲醛，涡旋混匀，振荡16 h，按照1.2进行样品的净化。

取所得的标准溶液，在正离子模式下分别对其进行质谱分析得到分子离子峰和碎片离子峰，从而选定母离子和子离子。SEM及其内标的衍生物的母离子均为[M+H]⁺。在此基础上进一步优化了监测离子、锥孔电压及碰撞能量等质谱参数（具体参数见表1）^[18]。其中SEM衍生物可能的裂解途径如图3所示。

图2 SEM的衍生化反应原理

Fig.2 Derivatization mechanism of SEM

图3 推测的SEM衍生物的质谱裂解途径

Fig. 3 The possible fragment pathways of SEM derivative

按照1.4节方法对标准溶液进行测定，在最优条件下，目标物的峰形较好，灵敏度较高，其中样品添加的典型色谱图见图4，其保留时间为2.25min。

图4 面粉中ADA终产物及¹³C¹⁵N-SEM衍生物的色谱图

Fig.4 Chromatogram of end-product of ADA and ¹³C¹⁵N-SEM derivative

2.3 分析方法的评价

采用1.3所得ADA最终产物和内标的峰面积之比（y）对质量浓度（x）做标准曲线，其线性方程为y = 1.3454 x - 0.2594，相关系数R²=0.9947。

以基质标准溶液进样，相当于基线噪音3倍水平的样品中ADA最终产物的浓度为最低浓度，在本色谱条件下，其LOD为0.12 mg/kg；以信噪比为10时的ADA添加浓度确定为本方法的定量限（LOQ），其LOQ为0.4 mg/kg。目前，部分文献提供的是食品中SEM的检出限^[12,15]，Chen等^[17]给出面粉中ADA的定量限为0.5 mg/kg，祁广建等^[19]和Ye等^[1]均确定最低检测限为1.0mg/kg，都大于本文的LOQ。

选择面粉空白样品，以0.4 mg/kg、0.8 mg/kg、4.0 mg/kg三个水平进行添加回收试验。称取样品后添加ADA标准溶液，静置30 min，使样品充分吸收，按照前述方法进行提取、净化和测定，每个水平做6次平行实验，计算方法的回收率和精密度。结果表明，面粉基质中添加的ADA的回收率为89.2% ~ 116.7%，相对标准偏差为7.8% ~ 13.2%。

表2 面粉中ADA三个添加水平的回收率和相对标准偏差

Table 2 Recoveries and RSDs for ADA from flour in three spiked levels

ADA添加水平 /（mg/kg）	平均回收率 / %	相对标准偏差 /（%，n=6）
0.4	89.2	13.2
0.8	115.4	7.8
4.0	116.7	11.4

2.4 样品分析

应用本方法对市售10种面粉样品进行测定，其中包括4种高筋小麦粉、2种面包用小麦粉、2种富强粉、2种低筋小麦粉，10种样品均未检出偶氮甲酰胺。

3 结论

本文将面粉进行湿热处理，使偶氮甲酰胺转化为氨基脲，通过测定氨基脲衍生物的含量对面粉中偶氮甲酰胺进行定量分析。在前处理过程中引入¹³C¹⁵N-SEM内标，可以校正提取和净化过程中目标物的损失，使定量结果更加准确可靠。方法学数据表明，该方法灵敏度高，重现性好，可用于面粉中偶氮甲酰胺的测定。

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食品安全检测仪器

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