液相色谱-质谱法测定饲料中的3种三嗪类抗球虫药

【核心介绍】本研究建立了高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的3种三嗪类抗球虫药，包括地克珠利（DIC）、妥曲珠利（TOL）和帕托珠利（PON）。样品经乙腈提取，HLB SPE柱净化，Unitary C18色谱柱分离，电喷雾串联四极杆质谱多反应监测方式测定。3种化合物溶液浓度在1μg/L至1000μg/L之间有良好的线性关系，相关系数（R2）> 0.999。6种空白饲料中分别添加3种三嗪类药物，添加水平为5μg/kg、20μg/kg、100μg/kg，回收率在74.66%～111.50%之间、相对标准偏差< 　

液相色谱-质谱法测定饲料中的3种三嗪类抗球虫药

范志影，赵丙超，刘庆生，田园

(中国农业科学院饲料研究所，北京，100081)

摘 要 本研究建立了高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的3种三嗪类抗球虫药，包括地克珠利（DIC）、妥曲珠利（TOL）和帕托珠利（PON）。样品经乙腈提取，HLB SPE柱净化，Unitary C18色谱柱分离，电喷雾串联四极杆质谱多反应监测方式测定。3种化合物溶液浓度在1μg/L至1000μg/L之间有良好的线性关系，相关系数（R²）> 0.999。6种空白饲料中分别添加3种三嗪类药物，添加水平为5μg/kg、20μg/kg、100μg/kg，回收率在74.66%～111.50%之间、相对标准偏差<10%。方法定量限为地克珠利1μg/kg、妥曲珠利和帕托珠利5μg/kg。该方法稳定、可靠，适合饲料样品中地克珠利、妥曲珠利和帕托珠利含量的测定。

关键词 地克珠利；妥曲珠利；帕托珠利；饲料；液相色谱串联质谱

中图分类号: S816

Determination of Three Triazine Coccidiostats Drug in Feed by LC-MS/MS

Fan Zhiying, Zhao Bingchao, Liu Qingsheng,  Tian Yuan

（Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China）

Abstract: A LC-MS/MS method for simultaneous determination of three triazine coccidiostats（diclazuril,toltrazuril and Ponazuril）in feed has been developed.The feed sample was extracted by acetonitrile, was cleaned up by HLB SPE column and was separated by Unitary C18 chromatographic column. And then the sample was measured by LC-MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) scan model. The technique allowed the determination of the compounds in the concentration range from 1 μg/L to 1000μg/L.Thecoefficient of linearity (R²) is higher than 0.999. The average recovery of the three compounds (spiked at the levels of 5μg/kg,20μg/kg,100μg/kg) ranges from 74.66% to 111.50%, and relative standard deviation is less than 10%. LOQ of diclazuril is 1μg/kg ,and LOQ of toltrazuril and ponazuril is 5μg/kg. The method is steady and reliable.It can meet the needs for the analysis of diclazuril,toltrazuril and ponazuril in feed.

Key words:Diclazuril；Toltrazuril；Ponazuril；Feed；LC-MS/MS

三嗪类抗球虫药主要有地克珠利、妥曲珠利和帕托珠利。该类药物的主要作用机理为抑制子孢子和裂殖子增殖，能有效降低畜禽养殖业因球虫感染带来的经济损失，具有低毒、广谱、用量小、安全范围广、无交叉耐药性、不受饲料制粒过程的影响等特点。但在该类药物的应用过程中，滥用药物、不遵守休药期等不合理的使用情况较为严重，并带来了一系列的兽药残留问题。各国政府和国际组织均制定了动物性食品中地克珠利的最大残留限量值及禽饲料中地克珠利的最大添加浓度。我国农业部《饲料添加剂使用规范》中有关规定地克珠利在饲料中的最大添加浓度为1 mg/kg，妥曲珠利和帕托珠利不在被允许使用的饲料添加剂范围内，原则上不允许在动物饲料中添加妥曲珠利和帕托珠利。

三嗪类化合物的测定方法有毛细管电泳法^[1]、高效液相色谱法^[2，3]和液相色谱串联质谱法^[4-11]。液质联用技术因其定性定量准确、检测灵敏度高等特点，目前在三嗪类药物残留及其代产物检测中为主要检测手段。

本研究中对6种代表性饲料样品（包括仔猪配合料、仔猪25%浓缩料、蛋鸡产蛋期5%复合预混料、蛋雏鸡配合饲料、畜产奶牛产奶期精料补充料和鱼配合料）进行了液相色谱串联质谱法测定三嗪类药物的方法学考察，对方法在饲料产品中的适用性以及检测方法的灵敏度、准确度及精密度进行了分析评价，证明该方法能够满足饲料中三嗪类抗球虫药的检测需求。

1. 材料与方法

1.1 仪器与设备

HPLC-MS/MS(6410，美国Agilent公司)；色谱柱：Unitary C18, 2.8μm,2.1mm×50mm （美国Agilent公司)；氮气吹干仪（BF-2000M，八方世纪公司）；超纯水净化仪（611 XW一80A，Sartorius公司）；冷冻离心机（IEC CL31R，美国Thermo公司）。

1.2 试剂与溶液

地克珠利（Diclazuril，DIC）、妥曲珠利（Toltrazuril，TOL）、帕托珠利(Ponazuril，PON)标准品购自德国Dr．Ehrenstorfer公司（含量大于98%）。乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯试剂（迪马公司），3CC HLB SPE柱（Waters公司）。

标准贮备液：精密称取各标准品用乙腈溶解定容，配制成浓度为1 mg/mL的标准贮备液。混合标准中间液：以乙腈为溶剂配制10 mg/mL混合标准中间液。标准系列溶液：吸取适量的混合标准中间液，用含0.1%甲酸的乙腈-水（1：1，V/V）溶液适当稀释成浓度为1 mg/L ～ 1000 mg/L的标准系列溶液，临用新配。

1.3 样品处理

1.3.1 提取

称取试样4g于50mL离心管中，加入20mL乙腈，加盖，超声提取20min，摇匀，6000 r/min 离心 10 min，取5mL上清液于小试管中，于50℃条件下氮气吹干，用1mL甲醇复溶残渣，再加入2mL水混合，即得到待净化提取液。

1.3.2 净化

将60mg HLB SPE柱安装于固相萃取装置上，依次用3mL甲醇、3mL水活化。将待净化提取液全部加载到SPE柱上，提取液通过SPE柱后，用3mL水清洗试管，清洗液也通过SPE柱，用3mL甲醇水混合溶液（3：7，V/V）淋洗SPE柱，真空抽干5min，用3mL甲醇洗脱，洗脱液收集于小试管。收集的洗脱液于50℃条件下氮气吹干，用1mL含0.1%甲酸的乙腈-水（1：1，V/V）溶液复溶残渣，通过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 仪器分析

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：Unitary C18，2.8μm，2.1mm×50mm；流动相： 0.1%甲酸溶液（A），0.1%甲酸乙腈溶液（B）。流动相的梯度程序为0min(50%B)，3min(70%B)，5min(70%B)，5.01min(100%B)， 11min(100%)，11.01min(50%B)，16min(50%B)。流速：0.30 ml/min，柱温：40℃，进样量：10μl。

1.4.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源，负离子扫描模式（ESI^¯）；检测方式：多反应监测（MRM）；电离电压：4.0kV；雾化温度：350℃；雾化气流速：9L/min；化合物定性定量离子对、碰撞能量、碎裂电压及参考保留时间见表1。

表1 质谱采集条件

Tab.1  Optimized MS/MS parameters

*:定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 提取与净化方法的优化

三嗪类药物以游离状态存在于饲料样品中，可选择适当的溶剂对目标化合物进行溶解提取。地克珠利等三嗪类化合物为弱极性物质，几乎不溶于水，易溶于甲苯、乙腈等有机溶剂。文献中多以甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取剂。本方法中选用乙腈为提取剂，能更有效地沉淀蛋白，减少杂质干扰。提取液净化的方法有很多种，包括碱性氧化铝小柱净化 ^[3]、C18小柱固相萃取^[4，8]、QuEChERS净化技术^[7]、GPC凝胶净化系统^[9]等。由于DIC、TOL和PON在HLB SPE柱上有强保留性，且方法简单、易实现，本研究采用HLB SPE柱对提取液进行净化处理，实验证明该方法有很好净化和回收效果。

2.2 固相萃取柱载荷量的考查

用固相萃取柱净化试液时应考虑固相萃取柱的萃取能力及样品溶液中被测物及干扰物的量，避免由于固相萃取柱过载而导致的试验误差。《饲料添加剂使用规范》中规定地克珠利在饲料中的最大添加浓度为1 mg/kg，本试验中以此最大添加浓度考查规格为60mg HLB SPE柱是否过载。在空白饲料样品中以1 mg/kg的浓度同时添加3种三嗪类药品（PON、DIC、TOL）以相同的提取和净化方法进行处理，上机前适当稀释，结果见表2。数据表明，该方法的提取与净化条件可以满足较高三嗪类药物含量的饲料样品的检测需求。

表2  C18固相萃取柱载荷量的考查结果

Tab.2  Test results of C18 SPE column load

2.3 液相条件的确定

文献中涉及三嗪类药物及其代谢物测定的方法中使用的色谱柱主要包括Venvsil ABS C18柱、Thermo Hypersil Gold C18柱、Agilent Poroshell 120EC C18柱等。本研究中也比较了三种规格的C18柱（Agilent Poroshell 120 SB C18柱、Unitray C18柱和Agilent ZorBax SB C18柱）。经试验比较后，选择Unitary C18柱（2.8μm, 2.1mm×50mm）为本方法中使用的色谱柱，该色谱柱可在4分钟内有效分离3种目标化合物，色谱峰分离度好，柱效高。采用0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相体系，对流速和淋洗液洗脱梯度进行优化，得到3种化合物的最佳分离效果。在优化的色谱条件下，帕托珠利（PON）、地克珠利（DIC）、妥曲珠利（TOL）参考保留时间分别为：2.239min，3.040min，4.105min（见图1）。

图1  3种三嗪类药物标准溶液色谱图（50μg/L）

Fig.1  The chromatogram of the three triazines standard solution（50μg/L）

2.4 质谱条件的确定

1μg/mL各药物标准溶液以流动注射的方式进样，通过全扫描的方式确定其母离子。再对母离子进行二级质谱扫描，得到碎片离子的二级质谱图。针对不同目标化合物以多反应监测（MRM）模式对其二级质谱的源内裂解电压、碰撞能量等参数进行优化，使化合物的定性定量离子的响应值更大。

在寻找目标化合物的特征碎片离子过程中发现，DIC可以产生特征子离子，其定性离子对为407/335.9和407/337.2，而TOL和PON在ESI负离子模式下无论在何种碰撞能量下都无法得到合适的离子碎片，此结论与文献报导一致^[6,7,9]。在此情况下可选择一级质谱单离子监测（SIM）模式^[6]，或二级质谱选择反应监测（SRM）模式^[7]和多反应监测（MRM）模式^[9]对TOL和PON的分子离子进行扫描。采用一级质谱单离子监测（SIM）模式扫描TOL和PON的分子离子时，基质干扰严重，噪声大，尤其浓缩饲料的基线噪声淹没5μg/L浓度的 PON和TOL，使检测灵敏度不足。当采用二级质谱多反应监测（MRM）模式时，样品的基质噪声明显降低，检测灵敏度提高，其信噪比可以满足检测要求。图2为浓度50μg/L时3种三嗪类药物监测离子MRM图。

1.PON，456.1>456.1；2. TOL，424.1>424.1；3. DIC，407.0>335.9；4. DIC，407.0>337.2

图2. 监测离子MRM图（50μg/L）

Fig.2 MRM spectra of monitor ion（50μg/L）

2.5 样品基质干扰的考查

由于TOL和PON的检测目标离子为分子离子，其选择性弱于更具化合物特征的定性离子对的DIC，因此有必要对样品基质干扰进行考查。对3种类型饲料样品（包括配合饲料、浓缩饲料和预混料）分别进行基质干扰考查。空白饲料样品和空白加标样品（5μg/kg）同样进行前处理步骤，并上机测定。图3、4表示了配合饲料样品基质干扰情况。由图可以看出样品基质对DIC干扰最小。不同类型饲料样品空白基质添加DIC标准品 5μg/kg，重复性试验5次，平均S/N为74.37，说明其检测灵敏度很高。而PON和TOL没有二级子离子，使用分子离子定性定量，抗干扰效果较差，图3显示空白样品中PON和TOL基线噪声较大。不同类型饲料样品中添加PON和TOL标准品 5μg/kg，重复性试验5次，平均S/N分别为9.48和6.93，接近检测下限。

图3  空白饲料MRM色谱图

Fig.3  MRM chromatograms of blank feed sample

图4  空白饲料添加标准品（5 μg/kg）MRM色谱图

Fig.4  MRM chromatograms of blank feed with 5 μg/kg standard substances added

2.6线性范围与线性相关

标准曲线系列溶液按照选定的仪器条件上机，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，曲线包括原点。表3为各标准曲线的线性方程、相关系数及仪器的检测下限。试验数据显示，3种三嗪类药物标准溶液浓度在1-1000 μg/L 范围内呈良好的线性相关，相关系数>0.999。当PON和TOL浓度为1μg/L时，S/N分别为4.30和3.11，DIC浓度为1μg/L时S/N为80.01，说明DIC的检测灵敏度更高，可以对更低浓度DIC进行检测。经过多次重复性试验，采用3倍信噪比法算得仪器的检测下限为PON：10 pg、TOL：10 pg 、DIC：1 pg。

表3线性方程、相关系数和检测限

Tab.3  Linear equation，correlation coefficient and LOD

2.7 准确度和精密度

在空白样品中加入一定浓度各标准药品，多次重复测定，计算加标回收率及方法的精密度。本试验共设置3个添加浓度，在空白试样中分别添加5μg/kg、20μg/kg、100μg/kg标准试剂，每浓度设置5个重复，进行回收率试验并计算批内精密度，重复3个批次试验，计算批间精密度（见表5-7）。

结果显示，PON的回收率均在86.25%～111.50%之间、相对标准偏差≤9.49%；DIC的回收率均在74.66%～107.90%之间、相对标准偏差≤7.16%；TOL的回收率均在80.26%～109.18%之间、相对标准偏差≤6.02%。批间相对标准偏差只有仔猪配合料添加5μg/kg妥曲珠利的试验组略高，为 11.59，其它试验组批间相对标准偏差均小于10。说明该方法对不同样品中、不同含量的PON、DIC和TOL的测定均有较好的准确度和精密度，证实了该方法在不同饲料样品中的适用性。

表4饲料中添加帕托珠利回收率及精密度试验结果

Tab.4  The results of recovery and precision test for adding ponazuril in feed

表5饲料中添加地克珠利回收率及精密度试验结果

Tab.5  The results of recovery and precision test for adding diclazuril in feed

表6饲料中添加妥曲珠利回收率及精精密度试验结果

Tab.6  The results of recovery and precision test for adding toltrazuril in feed

2.8 方法的定量限

由表4-6数据可见，6个不同的饲料样品添加5μg/kg药物标准品，分别重复处理5次，平均回收率在83%-112%之间，相对标准偏差均小于10%，说明饲料样品中含5μg/kg三嗪类药物时可得到准确的检测结果。此外，根据10倍信噪比方法确定定量下限，当空白饲料样品中添加5μg/kg目标化合物时，PON和TOL的信噪比约为10，DIC信噪比约为80。故将PON和TOL的定量限定为5μg/kg。由于DIC的检测灵敏度较高，采用10倍信噪比的计算方法，将DIC的定量限定为1μg/kg。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-串联质谱检法测定饲料样品中的3种三嗪类抗球虫药（包括地克球利、妥曲珠利和帕托珠利）。该方法具有相对快速和高选择性的特点，并通过方法学考查证明了该方法的高灵敏性、准确性和良好的重复性，适合包括配合饲料、浓缩饲料和预混料中地克球利、妥曲珠利和帕托珠利含量的测定。

参考文献

[1] 苏红晓，檀华蓉，沈虎琴，田春秋.分析测试学报，2013,23(2):156-161.

[2]杨迪，宗昕如，刘杰，张新晨，鲍恩东.扬州大学学报（农业与生命科学版），2014，35（4）：37-45。

[3]林仙军，陆春波，包爱情，周芷锦，罗成江，李孝军，应永飞.中国兽药杂志，2015，49（3）：53-57.

[4]Anna M.,Encarnacion M.,Maria T.G..Fast liquid chromatography/multiple-stage mass spectrometry of coccidiostats.Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009,23:1255-1263.

[5]周变华，王宏伟，薛飞群，赵振声.中国家禽，2011，33（21）：40-42.

[6]官小明，孙军，董静，于金玲，王洪涛.色谱，2011，29（3）：217-222.

[7]施祖灏，张小燕，卜士金，陈大伟，蒲俊华，高玉时，唐修君.色谱,2012，30（9）：883-888.

[8]赵岳，沈建忠，程林丽，谷青，刘凯丽，王莹.中国饲料，2012，（3）：36-39.

[9] Lianfeng Ai, Hanwen Sun ， Fengchi  Wang， Ruichun  Chen， Chunhai Guo。Determination of diclazuril, toltrazuril and its two metabolites in poultry tissuesand eggs by gel permeation chromatography–liquid chromatography–tandem mass spectrometry。Journal of Chromatography B, 879 (2011) 1757– 1763。

[10] Leen Mortier, Els Daeseleire, Carlos Van Peteghem。  Determination of the coccidiostat diclazuril in poultry feed and meat by liquid chromatography–tandem mass spectrometry。Analytica Chimica Acta 529 (2005) 229–234。

[11]  Myoung-Seok Kim， Jong-Hwan Lim， Youn-Hwan Hwang， Byung-Kwon Park，

In-Bae Song，Hyo-In Yun。Plasma disposition of toltrazuril and its metabolites, toltrazuril sulfoxide and toltrazuril sulfone, in rabbits after oral administration。Veterinary Parasitology 169 (2010) 51–56。

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