高效液相色谱法测定肠泰颗粒中齐墩果酸含量

Abstract：ObjectiveTo develop a method for determination of oleanolic acid in Changtai Granule. MethodsHPLC was carried out on a KR100-C18 ( 4. 6 mm ×250 mm ,5 μm) using MeOH-H2O-HOAc-TEA ( 85 ∶15∶0. 04 ∶0. 02 ) as the mobile phase, and the detection wavelength 220nm. ResultsThe standard curve was linear in the range of 2.04～10.2. μg. The average recovery and RSD% were 98. 60% and 1.76%. ConclusionThis method is accurate, reliable and provides a scientific index for the quality control of Changtai Granule.

　　Key words：Changtai Granule； Oleanolic acid； HPLC

　　肠泰颗粒是江苏省中西医结合医院王小宁院长的临床经验方，由白花蛇舌草、薏苡仁等7味中药材组成,用于大肠癌的术后辅助治疗，效果显著。本制剂的有效成分齐墩果酸具有护肝、解肝毒、降糖降脂、抗炎抗病毒、抗癌等作用［1］，齐墩果酸的抗癌作用几乎贯穿了肿瘤发展的各个阶段，包括抑制肿瘤的生成、诱发以及诱导细胞的分化，能有效地抑制肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的侵袭和转移［2］，可作为衡量制剂质量的指标之一。用于齐墩果酸的含量测定方法很多，较早应用比色法、中和法,操作复杂,显色误差较大,对酸性杂质无分辨力和选择性,所以近年来已少应用。薄层扫描法应用广泛,高效液相(HPLC)法有操作快速和准确性高的优势,正在取代其它方法。本文采用高效液相色谱法测定方中齐墩果酸的含量,为肠泰颗粒的质量标准研究奠定基础［3］。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；HH-6数显恒温水浴锅(金坛市丹瑞电器厂)；AB135S 十万分之一天平(METTLER公司)；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(南京金正数字仪器有限公司)。

　　1.2 试药齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110709 -200304)，乙醇(分析纯，南京化学试剂厂)，95%医用乙醇，水为乐百氏纯净水，乙腈、甲醇(色谱纯，美国天地公司)。肠泰颗粒(江苏省中医药研究院中药制剂室自制)。

　　2 方法与结果

　　2. 1 色谱条件［4］　

　　色谱柱为Kromasil KR100-C18 柱( 4. 6 mm ×250 mm ,5 μm)(带保护柱)， 流动相为甲醇∶水∶冰乙酸：三乙胺( 85 ∶15∶0.04∶0.02) , 流速0. 5 ml ·min - 1 ,检测波长220 nm ,柱温20 ℃,进样15 μl。图谱见图1 。

　　2.2 对照品溶液的制备

　　精密称取齐墩果酸对照品2.04 mg ,置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每毫升含齐墩果酸0.204 mg)。

　　2.3 供试品溶液的制备

　　取肠泰颗粒(批号071224)6 g,置于具塞三角瓶中，加甲醇50 ml,密闭超声30 min,补足重量，滤过，取续滤液25 ml,水浴挥干溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至5 ml，摇匀，0.45 μm滤膜滤过。

　　2.4 阴性对照品溶液的制备

　　取处方中缺白花蛇舌草等含齐墩果酸的药材,制成阴性对照颗粒,取阴性对照颗粒按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。

　　2.5 线性关系考察

　　精密吸取对照品溶液10 ,15 ,20 ,25 ,40，50 μl分别进样测定。以对照品进样量(μg) 为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线得回归方程Y= 363.19X - 74.10,r = 0.999 2,齐墩果酸在2.04～10.2 μg范围内线性关系良好。

　　2.6 精密度实验

　　精密吸取齐墩果酸对照品溶液重复进样5次。峰面积积分值RSD为1. 27 %，表明仪器精密度良好。

　　2.7 重复性实验

　　取肠泰颗粒(批号071224)5份,每份6 g,按供试品溶液制备方法,制得供试品溶液, 按上述色谱条件进行测定,测得供试品中含齐墩果酸含量RSD=1.31,表明重复性较好。

　　2.8 稳定性实验

　　取同一供试品溶液，分别在0，3，6，9，12 h进样，峰面积积分值RSD为2.37 %，表明样品稳定性良好。

　　2.9 回收率测定　

　　取肠泰颗粒(批号071224)6份，每份3 g,分别加入精密称取的齐墩果酸1.035 mg ,按“2.3”项下同法处理。按上述色谱条件进行测定。计算其回收率。结果见表1。表1 齐墩果酸回收率实验结果(略)

　　2.10 含量测定

　　取4批样品,按上述“2.3”方法操作,制备供试品溶液 ,按上述色谱条件进行测定。结果见表2。表2 齐墩果酸含量测定结果(略)

　　3 讨论

　　流动相曾选择乙腈-磷酸盐缓冲液体系、甲醇-水体系［5］、分离效果均不好，最后选用甲醇-水-冰乙酸-三乙胺体系，分离效果最好，达到基线分离。

　　实验过程中，曾比较了索氏提取与超声提取，结果含量基本一致，但索氏提取耗时较长，超声提取时间较短，易操作，所以采用超声提取的方法。